Kemična komponenta cevi iz nerjavečega jekla 304, struktura ektodomene SPACA6 vsebuje ohranjeno superdružino proteinov, povezanih s fuzijo gamet.

Hvala, ker ste obiskali Nature.com.Uporabljate različico brskalnika z omejeno podporo za CSS.Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju).Poleg tega, da zagotovimo stalno podporo, spletno mesto prikažemo brez slogov in JavaScripta.
Drsniki, ki prikazujejo tri članke na diapozitiv.Uporabite gumba za nazaj in naprej, da se premikate po diapozitivih, ali pa gumbe za krmiljenje diapozitivov na koncu, da se premikate po vsakem diapozitivu.

SPACA6 je površinski protein, izražen v spermi, ki je ključnega pomena za fuzijo game med spolnim razmnoževanjem sesalcev.Kljub tej temeljni vlogi je posebna funkcija SPACA6 slabo razumljena.Pojasnjujemo kristalno strukturo zunajcelične domene SPACA6 pri ločljivosti 2,2 Å, pri čemer razkrivamo dvodomenski protein, sestavljen iz štiriverižnega snopa in Ig-podobnih β-sendvičev, povezanih s kvazifleksibilnimi povezovalci.Ta struktura je podobna IZUMO1, drugemu proteinu, povezanemu s fuzijo gamet, zaradi česar sta SPACA6 in IZUMO1 ustanovna člana superdružine proteinov, povezanih z oploditvijo, ki jih tukaj imenujemo superdružina IST.Superdružino IST strukturno opredeljujejo njen zvit snop štirih vijačnic in par disulfidno povezanih motivov CXXC.Iskanje človeškega proteoma AlphaFold na podlagi strukture je identificiralo dodatne proteinske člane te superdružine;predvsem veliko teh proteinov sodeluje pri fuziji gamete.Struktura SPACA6 in njen odnos do drugih članov superdružine IST zagotavljata manjkajočo povezavo v našem znanju o fuziji gamet sesalcev.
Vsako človeško življenje se začne z dvema ločenima haploidnima gametama: očetovo spermo in materino jajčece.Ta sperma je zmagovalec intenzivnega selekcijskega procesa, med katerim milijoni semenčic prehajajo skozi ženski genitalni trakt, premagajo različne ovire1 in so podvrženi kapaciciji, kar poveča njihovo gibljivost in proces površinskih komponent2,3,4.Tudi če se semenčica in jajčna celica najdeta, proces še ni končan.Oocit je obdan s plastjo kumulusnih celic in glikoproteinsko pregrado, imenovano zona pellucida, skozi katero mora preiti semenčica, da vstopi v jajčno celico.Spermatozoidi uporabljajo kombinacijo površinskih adhezijskih molekul ter z membrano povezanih in izločenih encimov, da premagajo te končne ovire5.Te molekule in encimi so večinoma shranjeni v notranji membrani in akrosomalnem matriksu in jih zaznamo, ko se med akrosomsko reakcijo lizira zunanja membrana sperme6.Zadnji korak na tem intenzivnem potovanju je dogodek fuzije sperme in jajčeca, pri katerem dve celici združita svoje membrane, da postaneta en sam diploiden organizem7.Čeprav je ta proces prelomen v človeški reprodukciji, so potrebne molekularne interakcije slabo razumljene.
Poleg oploditve gamet je bila obsežno raziskana tudi kemija zlitja dveh lipidnih dvoslojev.Na splošno je membranska fuzija energetsko neugoden proces, ki zahteva, da se proteinski katalizator podvrže strukturni spremembi konformacije, ki zbliža dve membrani, prekine njuno kontinuiteto in povzroči fuzijo8,9.Ti proteinski katalizatorji so znani kot fuzogeni in so jih našli v neštetih fuzijskih sistemih.Potrebni so za vstop virusa v gostiteljske celice (npr. gp160 pri HIV-1, skok pri koronavirusih, hemaglutinin pri virusih influence)10,11,12 placente (sincitin)13,14,15 in fuzije, ki tvorijo gamete pri nižjih evkariontih ( HAP2/GCS1 pri rastlinah, protistih in členonožcih) 16,17,18,19.Fusogenov za človeške gamete še ni odkrili, čeprav se je izkazalo, da je več proteinov kritičnih za pritrditev in fuzijo gamete.CD9, izražen v oocitih, transmembranski protein, potreben za fuzijo mišjih in človeških gamet, je bil prvi odkrit 21,22,23.Čeprav njegova natančna funkcija ostaja nejasna, se zdi verjetna vloga pri adheziji, strukturi adhezijskih žarišč na jajčnih mikrovilih in/ali pravilni lokalizaciji proteinov na površini jajčne celice 24,25,26.Dva najbolj značilna proteina, ki sta kritična za zlitje gamete, sta protein sperme IZUMO127 in protein oocita JUNO28, njuno medsebojno povezovanje pa je pomemben korak pri prepoznavanju in adheziji gamete pred fuzijo.Samci Izumo1 knockout miši in samice Juno knockout miši so popolnoma sterilni, v teh modelih sperma vstopi v perivitelinični prostor, vendar se gamete ne spojijo.Podobno se je sotočje zmanjšalo, ko so bile gamete obdelane s protitelesi proti IZUMO1 ali JUNO27,29 v poskusih oploditve in vitro pri ljudeh.
Pred kratkim so odkrili novo odkrito skupino proteinov, izraženih v spermi, fenotipsko podobnih IZUMO1 in JUNO20,30,31,32,33,34,35.Protein 6, povezan z akrosomsko membrano sperme (SPACA6), je bil v obsežni študiji mutageneze pri miših ugotovljen kot bistven za oploditev.Vstavitev transgena v gen Spaca6 povzroči netaljive semenčice, čeprav se te semenčice infiltrirajo v perivitelinski prostor 36 .Poznejše študije izločitve pri miših so potrdile, da je Spaca6 potreben za fuzijo gamet 30,32.SPACA6 se izraža skoraj izključno v testisih in ima vzorec lokalizacije, podoben tistemu pri IZUMO1, in sicer znotraj intime spermijev pred akrosomsko reakcijo, nato pa migrira v ekvatorialno regijo po akrosomski reakciji 30,32.Homologi Spaca6 obstajajo pri različnih sesalcih in drugih evkariontih 30 in njihov pomen za fuzijo človeških gamet je bil dokazan z inhibicijo človeške oploditve in vitro z odpornostjo na SPACA6 30.Za razliko od IZUMO1 in JUNO ostajajo podrobnosti o strukturi, interakcijah in delovanju SPACA6 nejasne.
Za boljše razumevanje temeljnega procesa, na katerem temelji zlitje človeške sperme in jajčec, kar nam bo omogočilo informiranje o prihodnjem razvoju načrtovanja družine in zdravljenja plodnosti, smo izvedli strukturne in biokemične študije SPACA6.Kristalna struktura zunajcelične domene SPACA6 kaže štirivijačni snop (4HB) in imunoglobulinu podobno (Ig-podobno) domeno, povezano s kvazifleksibilnimi regijami.Kot je bilo predvideno v prejšnjih študijah, je 7,32,37 struktura domene SPACA6 podobna strukturi človeškega IZUMO1 in oba proteina imata nenavaden motiv: 4HB s trikotno vijačno površino in par disulfidno povezanih motivov CXXC.Predlagamo, da IZUMO1 in SPACA6 zdaj definirata večjo, strukturno sorodno superdružino proteinov, povezanih s fuzijo gamete.Z uporabo lastnosti, edinstvenih za superdružino, smo izvedli izčrpno iskanje strukturnega človeškega proteoma AlphaFold in identificirali dodatne člane te superdružine, vključno z več člani, ki sodelujejo pri fuziji gamet in/ali oploditvi.Zdaj se zdi, da obstaja skupna strukturna guba in naddružina proteinov, povezanih s fuzijo gamet, in naša struktura zagotavlja molekularni zemljevid tega pomembnega vidika mehanizma fuzije človeških gamet.
SPACA6 je transmembranski protein z enim prehodom z enim N-povezanim glikanom in šestimi domnevnimi disulfidnimi vezmi (sliki S1a in S2).Izrazili smo zunajcelično domeno človeškega SPACA6 (ostanki 27–246) v celicah Drosophila S2 in očistili protein z uporabo afinitete do niklja, kationske izmenjave in kromatografije za izključitev velikosti (slika S1b).Očiščena ektodomena SPACA6 je zelo stabilna in homogena.Analiza z uporabo kromatografije za izključitev velikosti v kombinaciji s poligonalnim sipanjem svetlobe (SEC-MALS) je pokazala en vrh z izračunano molekulsko maso 26,2 ± 0,5 kDa (slika S1c).To je skladno z velikostjo monomerne ektodomene SPACA6, kar kaže, da med čiščenjem ni prišlo do oligomerizacije.Poleg tega je spektroskopija s krožnim dikroizmom (CD) pokazala mešano strukturo α/β s tališčem 51,3 °C (sl. S1d,e).Dekonvolucija CD spektrov je pokazala 38,6 % α-vijačnih in 15,8 % β-verižnih elementov (slika S1d).
Ektodomena SPACA6 je bila kristalizirana z uporabo naključnega matričnega sejanja38, kar je povzročilo nabor podatkov z ločljivostjo 2,2 Å (tabela 1 in slika S3).Z uporabo kombinacije molekularne substitucije na osnovi fragmentov in podatkov o fazi SAD z izpostavljenostjo bromidu za določitev strukture (tabela 1 in slika S4) je končni prečiščeni model sestavljen iz ostankov 27–246.V času, ko je bila struktura določena, ni bilo na voljo eksperimentalnih ali AlphaFold struktur.Ektodomena SPACA6 meri 20 Å × 20 Å × 85 Å, sestavljena je iz sedmih vijačnic in devetih β-pramenov in ima podolgovato terciarno gubo, stabilizirano s šestimi disulfidnimi vezmi (sl. 1a, b).Šibka elektronska gostota na koncu stranske verige Asn243 kaže, da je ta ostanek N-povezana glikozilacija.Struktura je sestavljena iz dveh domen: N-terminalnega snopa s štirimi vijačnicami (4HB) in C-terminalne Ig podobne domene z vmesno zgibno regijo med njima (slika 1c).
a Struktura zunajcelične domene SPACA6.Trakasti diagram zunajcelične domene SPACA6, barva verige od N do C-konca od temno modre do temno rdeče.Cisteini, vključeni v disulfidne vezi, so poudarjeni v magenta.b Topologija zunajcelične domene SPACA6.Uporabite isto barvno shemo kot na sliki 1a.c zunajcelična domena SPACA6.Grafikoni trakov 4HB, tečaja in Ig podobne domene so obarvani oranžno, zeleno oziroma modro.Plasti niso narisane v merilu.
Domena 4HB SPACA6 vključuje štiri glavne vijačnice (vijačnice 1–4), ki so razporejene v obliki spiralne vijačnice (sl. 2a), ki se izmenjujejo med antiparalelnimi in vzporednimi interakcijami (sl. 2b).Majhna dodatna vijačnica z enim zavojem (vijačnica 1′) je položena pravokotno na snop in tvori trikotnik z vijačnicama 1 in 2. Ta trikotnik je rahlo deformiran v spiralno zasukanem pakiranju razmeroma gostega pakiranja vijačnic 3 in 4 ( Slika 2a).
Tabela trakov N-terminal 4HB.b Pogled od zgoraj na snop štirih vijačnic, pri čemer je vsaka vijačnica poudarjena temno modro na N-koncu in temno rdeče na C-koncu.c Diagram spiralnega kolesa od zgoraj navzdol za 4HB, pri čemer je vsak ostanek prikazan kot krog, označen z enočrkovno kodo aminokisline;oštevilčene so samo štiri aminokisline na vrhu kolesa.Nepolarni ostanki so obarvani rumeno, polarni nenabiti ostanki so obarvani zeleno, pozitivno nabiti ostanki so obarvani modro, negativno nabiti ostanki pa so obarvani rdeče.d Trikotne ploskve domene 4HB, s 4HB v oranžni barvi in ​​tečaji v zeleni barvi.Oba vložka prikazujeta disulfidne vezi v obliki palice.
4HB je koncentriran na notranjem hidrofobnem jedru, sestavljenem predvsem iz alifatskih in aromatskih ostankov (slika 2c).Jedro vsebuje disulfidno vez med Cys41 in Cys55, ki povezuje spirali 1 in 2 skupaj v zgornjem dvignjenem trikotniku (slika 2d).Dve dodatni disulfidni vezi sta bili oblikovani med motivom CXXC v Helix 1' in drugim motivom CXXC, najdenim na konici β-lasnice v območju tečaja (slika 2d).Konzervativni ostanek arginina z neznano funkcijo (Arg37) se nahaja znotraj votlega trikotnika, ki ga tvorijo vijačnice 1′, 1 in 2. Alifatski ogljikovi atomi Cβ, Cγ in Cδ Arg37 medsebojno delujejo s hidrofobnim jedrom, njegove gvanidinske skupine pa se ciklično premikajo med vijačnicama 1' in 1 prek interakcij med hrbtenico Thr32 in stransko verigo (sl. S5a, b).Tyr34 sega v votlino in pušča dve majhni votlini, skozi kateri lahko Arg37 komunicira s topilom.
Ig-podobne β-sendvič domene so velika superdružina proteinov, ki imajo skupno značilnost dveh ali več večverižnih amfipatskih β-plošč, ki medsebojno delujejo prek hidrofobnega jedra 39. C-terminalna Ig-podobna domena SPACA6 ima enak vzorec in je sestavljen iz dveh plasti (slika S6a).List 1 je β-list štirih pramenov (pramenov D, F, H in I), kjer prameni F, H in I tvorijo protivzporedno razporeditev, pramena I in D pa prevzameta vzporedno interakcijo.Tabela 2 je majhna antiparalelna dvoverižna beta plošča (prameni E in G).Med C-koncem verige E in središčem verige H (Cys170-Cys226) so opazili notranjo disulfidno vez (slika S6b).Ta disulfidna vez je analogna disulfidni vezi v β-sendvič domeni imunoglobulina40,41.
Štirinitna β-plošča se zvije po celotni dolžini in tvori asimetrične robove, ki se razlikujejo po obliki in elektrostatiki.Tanjši rob je ravna hidrofobna okoljska površina, ki izstopa v primerjavi s preostalimi neravnimi in elektrostatično raznolikimi površinami v SPACA6 (sl. S6b,c).Halo izpostavljenih karbonilnih/amino skupin in polarnih stranskih verig obdaja hidrofobno površino (slika S6c).Širši rob je prekrit z zaprtim vijačnim segmentom, ki blokira N-terminalni del hidrofobnega jedra in tvori tri vodikove vezi z odprto polarno skupino hrbtenice verige F (slika S6d).C-terminalni del tega roba tvori velik žep z delno izpostavljenim hidrofobnim jedrom.Žep je obdan s pozitivnimi naboji zaradi treh sklopov dvojnih argininskih ostankov (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 in Arg212-Arg214) in osrednjega histidina (His220) (slika S6e).
Zgibno območje je kratek segment med vijačno domeno in Ig-podobno domeno, sestavljen iz ene antiparalelne triverižne β-plasti (prameni A, B in C), majhne vijačnice 310 in več dolgih naključnih vijačnih segmentov.(slika S7).Zdi se, da mreža kovalentnih in elektrostatičnih kontaktov v območju tečaja stabilizira orientacijo med 4HB in domeno, podobno Ig.Mrežo lahko razdelimo na tri dele.Prvi del vključuje dva motiva CXXC (27CXXC30 in 139CXXC142), ki tvorita par disulfidnih vezi med β-lasnico v tečaju in vijačnico 1' v 4HB.Drugi del vključuje elektrostatične interakcije med Ig-podobno domeno in tečajem.Glu132 v tečaju tvori solni most z Arg233 v Ig-podobni domeni in Arg135 v tečaju.Tretji del vključuje kovalentno vez med Ig-podobno domeno in zgibno regijo.Dve disulfidni vezi (Cys124-Cys147 in Cys128-Cys153) povezujeta tečajno zanko s povezovalnikom, ki je stabiliziran z elektrostatičnimi interakcijami med Gln131 in hrbtenično funkcionalno skupino, kar omogoča dostop do prve domene, podobne Ig.veriga.
Struktura ektodomene SPACA6 in posamezne strukture 4HB in Ig podobnih domen smo uporabili za iskanje strukturno podobnih zapisov v podatkovnih bazah proteinov 42 .Identificirali smo ujemanja z visokimi rezultati Dali Z, majhnimi standardnimi odstopanji in velikimi rezultati LALI (slednji je število strukturno enakovrednih ostankov).Medtem ko je imelo prvih 10 zadetkov iz iskanja celotne ektodomene (tabela S1) sprejemljivo Z-rezultat >842, je samo iskanje 4HB ali Ig podobne domene pokazalo, da večina teh zadetkov ustreza samo β-sendvičem.vseprisotna guba, ki jo najdemo v mnogih beljakovinah.Vsa tri iskanja v Daliju so vrnila samo en rezultat: IZUMO1.
Že dolgo se domneva, da imata SPACA6 in IZUMO1 strukturne podobnosti7,32,37.Čeprav imata ektodomeni teh dveh proteinov, povezanih s fuzijo gamete, le 21 % enake sekvence (slika S8a), so zapleteni dokazi, vključno z vzorcem ohranjene disulfidne vezi in predvideno C-terminalni Ig podobni domeni v SPACA6, omogočili zgodnje poskuse izgradnje homološki model miške A a SPACA6 z uporabo IZUMO1 kot predloge37.Naša struktura potrjuje te napovedi in kaže resnično stopnjo podobnosti.Pravzaprav imata strukturi SPACA6 in IZUMO137,43,44 isto dvodomensko arhitekturo (slika S8b) s podobnimi 4HB in Ig podobnimi β-sendvič domenami, povezanimi z zgibno regijo (slika S8c).
IZUMO1 in SPACA6 4HB imata skupne razlike od običajnih spiralnih snopov.Tipični 4HB, kot so tisti, ki jih najdemo v proteinskih kompleksih SNARE, vključenih v endosomsko fuzijo 45, 46, imajo enakomerno razporejene vijačnice, ki ohranjajo konstantno ukrivljenost okoli osrednje osi 47. V nasprotju s tem so bile vijačne domene v IZUMO1 in SPACA6 popačene, s spremenljivo ukrivljenostjo in neenakomerno pakiranje (slika S8d).Zasuk, ki ga verjetno povzroča trikotnik, ki ga tvorijo vijačnice 1', 1 in 2, je ohranjen v IZUMO1 in SPACA6 in stabiliziran z istim motivom CXXC na vijačnici 1'.Vendar pa dodatna disulfidna vez, ki jo najdemo v SPACA6 (Cys41 in Cys55 kovalentno povezujeta vijačnici 1 in 2 zgoraj) ustvari ostrejši vrh na vrhu trikotnika, zaradi česar je SPACA6 bolj zavit kot IZUMO1, z bolj izrazitimi trikotniki votlin.Poleg tega IZUMO1 nima Arg37, opaženega v središču te votline v SPACA6.V nasprotju s tem ima IZUMO1 bolj tipično hidrofobno jedro alifatskih in aromatskih ostankov.
IZUMO1 ima domeno, podobno Ig, ki jo sestavljata dvoverižna in petverižna β-plast43.Dodatna veriga v IZUMO1 nadomešča tuljavo v SPACA6, ki medsebojno deluje z verigo F, da omeji osrednje vodikove vezi v verigi.Zanimiva točka primerjave je predviden površinski naboj Ig-podobnih domen obeh proteinov.Površina IZUMO1 je bolj negativno nabita kot površina SPACA6.Dodaten naboj se nahaja blizu C-konca, ki je obrnjen proti membrani sperme.V SPACA6 so bile iste regije bolj nevtralne ali pozitivno nabite (slika S8e).Na primer, hidrofobna površina (tanjši robovi) in pozitivno nabite jamice (širši robovi) v SPACA6 so negativno nabiti v IZUMO1.
Čeprav so razmerje in elementi sekundarne strukture med IZUMO1 in SPACA6 dobro ohranjeni, je strukturna poravnava Ig-podobnih domen pokazala, da se obe domeni razlikujeta v svoji splošni orientaciji glede na drugo (slika S9).Spiralni snop IZUMO1 je ukrivljen okoli β-sendviča, kar ustvarja prej opisano obliko "bumeranga" pri približno 50° od osrednje osi.V nasprotju s tem je bil spiralni žarek v SPACA6 nagnjen za približno 10 ° v nasprotno smer.Razlike v teh orientacijah so verjetno posledica razlik v območju tečaja.Na primarni ravni zaporedja imata IZUMO1 in SPACA6 malo podobnosti zaporedja na tečaju, z izjemo ostankov cisteina, glicina in asparaginske kisline.Posledično so vodikove vezi in elektrostatične mreže popolnoma drugačne.Elemente sekundarne strukture β-listov si delita IZUMO1 in SPACA6, čeprav so verige v IZUMO1 veliko daljše in je vijačnica 310 (vijačnica 5) edinstvena za SPACA6.Te razlike povzročijo različne orientacije domen za dva sicer podobna proteina.
Naše iskanje po strežniku Dali je razkrilo, da sta SPACA6 in IZUMO1 edini dve eksperimentalno določeni strukturi, shranjeni v zbirki podatkov o beljakovinah, ki imata to posebno gubo 4HB (tabela S1).Pred kratkim je DeepMind (Alphabet/Google) razvil AlphaFold, sistem na osnovi nevronske mreže, ki lahko natančno napove 3D strukture proteinov iz primarnih sekvenc48.Kmalu po tem, ko smo rešili strukturo SPACA6, je bila izdana baza podatkov AlphaFold, ki zagotavlja modele napovedne strukture, ki pokrivajo 98,5 % vseh beljakovin v človeškem proteomu48,49.Z uporabo naše razrešene strukture SPACA6 kot iskalnega modela je iskanje strukturne homologije za model v človeškem proteomu AlphaFold identificiralo kandidate z možnimi strukturnimi podobnostmi s SPACA6 in IZUMO1.Glede na neverjetno natančnost AlphaFold pri napovedovanju SPACA6 (slika S10a) – zlasti ektodomene 1,1 Å rms v primerjavi z našo razrešeno strukturo (slika S10b) – smo lahko prepričani, da bodo ugotovljena ujemanja SPACA6 verjetno točna.
Prej je PSI-BLAST iskal skupino IZUMO1 s tremi drugimi proteini, povezanimi s spermo: IZUMO2, IZUMO3 in IZUMO450.AlphaFold je napovedal, da se ti proteini družine IZUMO zvijejo v domeno 4HB z enakim vzorcem disulfidne vezi kot IZUMO1 (sliki 3a in S11), čeprav nimajo domene, podobne Ig.Domneva se, da sta IZUMO2 in IZUMO3 enostranska membranska proteina, podobna IZUMO1, medtem ko se zdi, da se IZUMO4 izloča.Funkcije proteinov IZUMO 2, 3 in 4 pri fuziji gamete niso bile določene.Znano je, da igra IZUMO3 vlogo pri biogenezi akrosoma med razvojem sperme51 in ugotovljeno je bilo, da protein IZUMO tvori kompleks50.Ohranjanje proteinov IZUMO pri sesalcih, plazilcih in dvoživkah kaže, da je njihova potencialna funkcija skladna z drugimi znanimi proteini, povezanimi s fuzijo gamete, kot so DCST1/2, SOF1 in FIMP.
Diagram domenske arhitekture superdružine IST, s 4HB, tečajem in Ig podobnimi domenami, poudarjenimi z oranžno, zeleno in modro.IZUMO4 ima edinstveno območje C-terminala, ki je videti črno.Potrjene in domnevne disulfidne vezi so prikazane s polnimi oziroma pikčastimi črtami.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) in TMEM95 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) so prikazani v istem barvnem obsegu kot plošča A. Disulfidne vezi so prikazane v magenta.Transmembranske vijačnice TMEM95, IZUMO2 in IZUMO3 niso prikazane.
Za razliko od proteina IZUMO naj bi se drugi proteini SPACA (tj. SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 in SPACA9) strukturno razlikovali od SPACA6 (slika S12).Samo SPACA9 ima 4HB, vendar se ne pričakuje, da bo imel enako vzporedno-anti-vzporedno orientacijo ali enako disulfidno vez kot SPACA6.Samo SPACA1 ima podobno domeno, podobno Ig.AlphaFold predvideva, da imajo SPACA3, SPACA4 in SPACA5 popolnoma drugačno strukturo kot SPACA6.Zanimivo je, da ima SPACA4 tudi vlogo pri oploditvi, vendar v večji meri kot SPACA6, namesto da olajša interakcijo med spermo in oocitno cono pellucida52.
Naše iskanje AlphaFold je našlo drugo ujemanje za IZUMO1 in SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, en sam transmembranski protein, specifičen za spermo, naredi mišje samce neplodne po ablaciji 32,33.Spermatozoidi brez TMEM95 so imeli normalno morfologijo, gibljivost in sposobnost, da prodrejo v cono pellucida in se vežejo na membrano jajčeca, vendar se niso mogli zliti z membrano oocita.Prejšnje študije so pokazale, da ima TMEM95 strukturne podobnosti z IZUMO133.Dejansko je model AlphaFold potrdil, da je TMEM95 4HB z istim parom motivov CXXC kot IZUMO1 in SPACA6 in enako dodatno disulfidno vezjo med vijačnicama 1 in 2, ki jo najdemo v SPACA6 (sl. 3a in S11).Čeprav TMEM95 nima domene, podobne Ig, ima regijo z vzorcem disulfidne vezi, ki je podobna tečajnim regijam SPACA6 in IZUMO1 (slika 3b).V času objave tega rokopisa je strežnik za prednatis poročal o strukturi TMEM95, kar je potrdilo rezultat AlphaFold53.TMEM95 je zelo podoben SPACA6 in IZUMO1 in je evolucijsko ohranjen že pri dvoživkah (sl. 4 in S13).
Iskanje PSI-BLAST je uporabilo baze podatkov NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP in SOF1 za določitev položaja teh zaporedij v drevesu življenja.Razdalje med vejami niso prikazane v merilu.
Osupljiva splošna strukturna podobnost med SPACA6 in IZUMO1 nakazuje, da sta ustanovna člana ohranjene strukturne superdružine, ki vključuje proteine ​​TMEM95 in IZUMO 2, 3 in 4.znani člani: IZUMO1, SPACA6 in TMEM95.Ker ima le nekaj članov Ig-podobne domene, je zaščitni znak naddružine IST domena 4HB, ki ima edinstvene značilnosti, skupne vsem tem proteinom: 1) Zvit 4HB z vijačnicami, razporejenimi v antiparalelni/paralelni menjavi (slika 5a), 2) snop ima trikotno ploskev, ki je sestavljena iz dveh vijačnic znotraj snopa in tretje navpične vijačnice (sl. ključno območje (sl. 5c). Znano je, da motiv CXXC, ki ga najdemo v proteinih, podobnih tioredoksinu, deluje kot redoks senzor 54,55,56, medtem ko je motiv pri članih družine IST lahko povezan s protein disulfidnimi izomerazami, kot je ERp57 pri fuziji gamet.Vloge so povezane 57,58.
Člane superdružine IST definirajo tri značilne lastnosti domene 4HB: štiri vijačnice, ki se izmenjujejo med vzporedno in antiparalelno orientacijo, ba-trikotne ploskve spiralnih snopov in ca CXXC dvojni motiv, oblikovan med majhnimi molekulami.) N-terminalne vijačnice (oranžne) in območje tečaja β-lasnica (zelena).
Glede na podobnost med SPACA6 in IZUMO1 je bila testirana sposobnost prvega, da se veže na IZUMO1 ali JUNO.Interferometrija bioplasti (BLI) je kinetična vezavna metoda, ki je bila prej uporabljena za kvantificiranje interakcije med IZUMO1 in JUNO.Po inkubaciji senzorja, označenega z biotinom, z IZUMO1 kot vabo z visoko koncentracijo analita JUNO, je bil zaznan močan signal (slika S14a), ki kaže na vezavo povzročeno spremembo v debelini biomateriala, pritrjenega na konico senzorja.Podobni signali (tj. JUNO, povezan s senzorjem kot vaba proti analitu IZUMO1) (slika S14b).Ko je bil SPACA6 uporabljen kot analit proti IZUMO1, vezanem na senzor, ali JUNO, vezanem na senzor, ni bil zaznan noben signal (slika S14a,b).Odsotnost tega signala kaže, da zunajcelična domena SPACA6 ne deluje z zunajcelično domeno IZUMO1 ali JUNO.
Ker test BLI temelji na biotinilaciji prostih ostankov lizina na beljakovini vabe, lahko ta modifikacija prepreči vezavo, če so v interakcijo vključeni ostanki lizina.Poleg tega lahko orientacija vezave glede na senzor ustvari sterične ovire, zato so bili na rekombinantnih ektodomenah SPACA6, IZUMO1 in JUNO opravljeni tudi običajni testi spuščanja.Kljub temu se SPACA6 ni oboril z IZUMO1 z oznako His ali JUNO z oznako His (sl. S14c,d), kar kaže na nobeno interakcijo, ki bi bila skladna s tisto, opaženo v poskusih BLI.Kot pozitivno kontrolo smo potrdili interakcijo JUNO z označenim Hisom IZUMO1 (sliki S14e in S15).
Kljub strukturni podobnosti med SPACA6 in IZUMO1 nezmožnost SPACA6, da veže JUNO, ni presenetljiva.Površina človeškega IZUMO1 ima več kot 20 ostankov, ki medsebojno delujejo z JUNO, vključno z ostanki iz vsake od treh regij (čeprav se jih večina nahaja v območju tečaja) (slika S14f).Od teh ostankov je samo eden ohranjen v SPACA6 (Glu70).Medtem ko so številne substitucije ostankov ohranile svoje prvotne biokemične lastnosti, je bil bistveni ostanek Arg160 v IZUMO1 nadomeščen z negativno nabitim Asp148 v SPACA6;prejšnje študije so pokazale, da mutacija Arg160Glu v IZUMO1 skoraj popolnoma odpravi vezavo na JUNO43.Poleg tega je razlika v orientaciji domene med IZUMO1 in SPACA6 znatno povečala površino JUNO-vezavnega mesta ekvivalentne regije na SPACA6 (slika S14g).
Kljub znani potrebi po SPACA6 za fuzijo gamet in njegovi podobnosti z IZUMO1 se zdi, da SPACA6 nima enakovredne funkcije vezave JUNO.Zato smo skušali združiti naše strukturne podatke z dokazi o pomembnosti, ki jih zagotavlja evolucijska biologija.Poravnava zaporedja homologov SPACA6 kaže ohranitev skupne strukture zunaj sesalcev.Na primer, ostanki cisteina so prisotni celo pri dvoživkah, ki so v daljnem sorodstvu (slika 6a).Z uporabo strežnika ConSurf so bili podatki o hrambi več poravnav zaporedja 66 zaporedij preslikani na površino SPACA6.Ta vrsta analize lahko pokaže, kateri ostanki so se ohranili med razvojem beljakovin, in lahko pokaže, katere površinske regije igrajo vlogo pri delovanju.
Poravnava zaporedja ektodomen SPACA6 iz 12 različnih vrst, pripravljenih z uporabo CLUSTAL OMEGA.Po analizi ConSurf so z modro označene najbolj konzervativne pozicije.Cisteinski ostanki so označeni z rdečo.Meje domene in elementi sekundarne strukture so prikazani na vrhu poravnave, kjer puščice označujejo β-pramene, valovi pa vijačnice.Identifikatorji dostopa NCBI, ki vsebujejo zaporedja, so: človek (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), opica kapucin (Cebus mimic, XP_017359366), konj (Equus caballus, XP_023506102), kit ubijalec (Orc inus orca3_23 XP_032_034) .), ovca (Ovis aries, XP_014955560), slon (Loxodonta africana, XP_010585293), pes (Canis lupus familyis, XP_025277208), miš (Mus musculus, NP_001156381), tasmanski hudič (Sarcophilus harrisii, XP_03611, XP_0) 318), Platypus, 8) , 61_89 in Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Številčenje temelji na človeškem vrstnem redu.b Površinska predstavitev strukture SPACA6 s 4HB na vrhu in Ig podobno domeno na dnu, barve temeljijo na ocenah ohranjenosti s strežnika ConSurf.Najbolje ohranjeni deli so v modri barvi, srednje ohranjeni v beli barvi, najmanj ohranjeni pa v rumeni barvi.vijolični cistein.Tri površinske zaplate, ki izkazujejo visoko stopnjo zaščite, so prikazane na vstavku z oznakami 1, 2 in 3. Karikatura 4HB je prikazana na vstavku zgoraj desno (ista barvna shema).
Struktura SPACA6 ima tri zelo ohranjene površinske regije (slika 6b).Obliž 1 obsega 4HB in zgibno regijo ter vsebuje dva ohranjena disulfidna mostova CXXC, zgibno mrežo Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (slika S7) in tri ohranjene zunanje aromatske ostanke (Phe31, Tyr73, Phe137)).širši rob domene, podobne Ig (slika S6e), ki predstavlja več pozitivno nabitih ostankov na površini sperme.Zanimivo je, da ta obliž vsebuje protitelesni epitop, za katerega je bilo prej dokazano, da moti delovanje SPACA6 30.Regija 3 obsega tečaj in eno stran domene, podobne Ig;ta regija vsebuje ohranjene proline (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) in navzven obrnjene polarne/nabite ostanke.Presenetljivo je, da je večina ostankov na površini 4HB zelo variabilnih (sl. 6b), čeprav je guba ohranjena v celotnem homologu SPACA6 (kot kaže konzervativizem jedra hidrofobnega snopa) in onkraj superdružine IST.
Čeprav je to najmanjša regija v SPACA6 z najmanj zaznavnimi sekundarnimi strukturnimi elementi, je veliko ostankov tečajne regije (vključno z regijo 3) visoko ohranjenih med homologi SPACA6, kar lahko kaže na to, da igra orientacija vijačnega snopa in β-sendviča vlogo.kot konservativec.Vendar pa je kljub obsežnim vodikovim vezim in elektrostatičnim mrežam v območju tečajev SPACA6 in IZUMO1 mogoče videti dokaze o intrinzični prožnosti v poravnavi več dovoljenih struktur IZUMO137,43,44.Poravnava posameznih domen se je dobro prekrivala, vendar se je orientacija domen med seboj spreminjala od 50 ° do 70 ° od osrednje osi (slika S16).Za razumevanje konformacijske dinamike SPACA6 v raztopini so bili izvedeni poskusi SAXS (sl. S17a,b).Ab initio rekonstrukcija ektodomene SPACA6 je ustrezala paličasti kristalni strukturi (sl. S18), čeprav je graf Kratky pokazal določeno stopnjo prožnosti (sl. S17b).Ta konformacija je v nasprotju z IZUMO1, v katerem nevezani protein prevzame obliko bumeranga tako v rešetki kot v raztopini43.
Za specifično identifikacijo prožne regije je bila izvedena masna spektroskopija izmenjave vodik-devterij (H-DXMS) na SPACA6 in primerjana s podatki, predhodno pridobljenimi na IZUMO143 (sl. 7a,b).SPACA6 je očitno bolj prilagodljiv kot IZUMO1, kar dokazuje večja izmenjava devterija v celotni strukturi po 100.000 s izmenjave.V obeh strukturah C-terminalni del tečajne regije kaže visoko stopnjo izmenjave, kar verjetno omogoča omejeno rotacijo 4HB in Ig podobnih domen glede na drugo.Zanimivo je, da je C-terminalni del tečaja SPACA6, ki je sestavljen iz ostanka 147CDLPLDCP154, visoko ohranjena regija 3 (slika 6b), kar morda kaže, da je prožnost med domenami evolucijsko ohranjena lastnost SPACA6.Glede na analizo prožnosti so podatki o termičnem taljenju CD-ja pokazali, da je SPACA6 (Tm = 51,2 °C) manj stabilen kot IZUMO1 (Tm = 62,9 °C) (sl. S1e in S19).
a H-DXMS slike SPACA6 in b IZUMO1.Odstotek izmenjave devterija je bil določen v navedenih časovnih točkah.Ravni izmenjave vodik-devterij so označene z barvo na gradientni lestvici od modre (10 %) do rdeče (90 %).Črne skrinjice predstavljajo področja visoke menjave.Meje 4HB, tečaja in Ig podobne domene, opažene v kristalni strukturi, so prikazane nad primarnim zaporedjem.Ravni izmenjave devterija pri 10 s, 1000 s in 100.000 s so bile narisane na trakasti diagram, ki je bil nadgrajen na prozornih molekularnih površinah SPACA6 in IZUMO1.Deli struktur s stopnjo izmenjave devterija pod 50 % so obarvani belo.Območja nad 50 % izmenjave H-DXMS so obarvana v gradientni lestvici.
Uporaba CRISPR/Cas9 in genetskih strategij za izločitev mišjega gena je vodila do identifikacije več dejavnikov, pomembnih za vezavo in fuzijo semenčic in jajčec.Poleg dobro označene interakcije strukture IZUMO1-JUNO in CD9 ostaja večina proteinov, povezanih s fuzijo gamete, strukturno in funkcionalno enigmatična.Biofizična in strukturna karakterizacija SPACA6 je še en del molekularne sestavljanke adhezije/fuzije med oploditvijo.
Zdi se, da so SPACA6 in drugi člani superdružine IST zelo ohranjeni pri sesalcih, pa tudi pri posameznih pticah, plazilcih in dvoživkah;pravzaprav se domneva, da je SPACA6 celo potreben za oploditev pri cebricah 59. Ta porazdelitev je podobna drugim znanim proteinom, povezanim s fuzijo gamet, kot so DCST134, DCST234, FIMP31 in SOF132, kar kaže, da so ti dejavniki pomanjkljivi za HAP2 (tudi znani kot GCS1), ki so odgovorni za katalitično aktivnost mnogih protistov., rastline in členonožci.Oplojeni fuzijski proteini 60, 61. Kljub veliki strukturni podobnosti med SPACA6 in IZUMO1 je izločitev genov, ki kodirajo enega od teh proteinov, povzročila neplodnost pri mišjih samcih, kar kaže, da se njihove funkcije pri zlitju gamet ne podvajajo..Gledano širše, nobeden od znanih proteinov sperme, potrebnih za fazo adhezije fuzije, ni odveč.
Ostaja odprto vprašanje, ali SPACA6 (in drugi člani superdružine IST) sodelujejo v intergametnih stikih, tvorijo intragametna omrežja za rekrutiranje pomembnih proteinov v fuzijske točke ali morda celo delujejo kot izmuzljivi fuzogeni.Študije soimunoprecipitacije v celicah HEK293T so pokazale interakcijo med IZUMO1 v polni dolžini in SPACA632.Vendar pa naše rekombinantne ektodomene niso medsebojno vplivale in vitro, kar kaže na to, da so interakcije, opažene pri Nodi et al.sta bila oba izbrisana v konstruktu (upoštevajte citoplazemski rep IZUMO1, za katerega se je izkazalo, da ni potreben za oploditev62).Druga možnost je, da IZUMO1 in/ali SPACA6 zahtevata posebna vezavna okolja, ki jih ne reproduciramo in vitro, kot so fiziološko specifične konformacije ali molekularni kompleksi, ki vsebujejo druge proteine ​​(znane ali še neodkrite).Čeprav se domneva, da ektodomena IZUMO1 posreduje pri pritrditvi semenčic na jajčece v perivitelinskem prostoru, namen ektodomene SPACA6 ni jasen.
Struktura SPACA6 razkriva več ohranjenih površin, ki so lahko vključene v interakcije protein-protein.Ohranjeni del območja tečaja, ki je neposredno ob motivu CXXC (označen kot obliž 1 zgoraj), ima več navzven obrnjenih aromatskih ostankov, ki so pogosto povezani s hidrofobnimi interakcijami in interakcijami π-zlaganja med biomolekulami.Široke stranice domene, podobne Ig (regija 2), tvorijo pozitivno nabit utor z visoko ohranjenimi ostanki Arg in His, protitelesa proti tej regiji pa so bila prej uporabljena za blokiranje fuzije gamete 30 .Protitelo prepozna linearni epitop 212RIRPAQLTHRGTFS225, ki ima tri od šestih ostankov arginina in visoko ohranjen His220.Ni jasno, ali je disfunkcija posledica blokade teh specifičnih ostankov ali celotne regije.Lokacija te vrzeli blizu C-konca β-sendviča kaže na cis-interakcije s sosednjimi proteini sperme, ne pa tudi z beljakovinami oocitov.Poleg tega je lahko zadrževanje zelo prožnega s prolinom bogatega zapleta (mesto 3) znotraj tečaja mesto interakcije protein-protein ali, bolj verjetno, kaže na zadrževanje prožnosti med obema domenama.Spol je pomemben za neznano vlogo SPACA6.fuzija gameta.
SPACA6 ima lastnosti medceličnih adhezijskih proteinov, vključno z Ig-podobnimi β-sendviči.Številni adhezivni proteini (npr. kadherini, integrini, adhezini in IZUMO1) imajo eno ali več β-sendvič domen, ki razširjajo proteine ​​od celične membrane do njihovih okoljskih tarč63,64,65.Ig-podobna domena SPACA6 vsebuje tudi motiv, ki ga običajno najdemo v β-sendvičih adhezije in kohezije: dvojniki vzporednih pramenov na koncih β-sendvičev, znani kot mehanske spone66.Menijo, da ta motiv poveča odpornost na strižne sile, kar je dragoceno za beljakovine, ki sodelujejo pri medceličnih interakcijah.Vendar kljub tej podobnosti z adhezini trenutno ni dokazov, da SPACA6 medsebojno deluje z jajčnimi beljaki.Ektodomena SPACA6 se ne more vezati na JUNO in celice HEK293T, ki izražajo SPACA6, kot je prikazano tukaj, komaj sodelujejo z jajčnimi celicami brez cone 32.Če SPACA6 vzpostavi intergametične vezi, lahko te interakcije zahtevajo posttranslacijske modifikacije ali pa jih stabilizirajo drugi proteini sperme.V podporo slednji hipotezi se spermatozoidi s pomanjkanjem IZUMO1 vežejo na jajčne celice, kar dokazuje, da so molekule, ki niso IZUMO1, vključene v korak adhezije gamete 27.
Številni virusni, celični in razvojni fuzijski proteini imajo lastnosti, ki napovedujejo njihovo funkcijo kot fuzogeni.Na primer, virusni fuzijski glikoproteini (razredi I, II in III) imajo hidrofobni fuzijski peptid ali zanko na koncu proteina, ki je vstavljen v gostiteljsko membrano.Zemljevid hidrofilnosti IZUMO143 in struktura (določena in predvidena) superdružine IST nista pokazala nobenega očitnega hidrofobnega fuzijskega peptida.Torej, če kateri koli protein v superdružini IST deluje kot fuzogen, to počne na način, ki se razlikuje od drugih znanih primerov.
Skratka, funkcije članov superdružine proteinov IST, povezanih s fuzijo gamete, ostajajo mučna skrivnost.Naša značilna rekombinantna molekula SPACA6 in njena razrešena struktura bosta zagotovili vpogled v razmerja med temi skupnimi strukturami in njihovo vlogo pri pritrditvi in ​​fuziji gamete.
Zaporedje DNA, ki ustreza predvideni človeški ektodomeni SPACA6 (pristopna številka NCBI NP_001303901.1; ostanki 27–246), je bilo kodonsko optimizirano za izražanje v celicah Drosophila melanogaster S2 in sintetizirano kot genski fragment z zaporedjem, ki kodira Kozak (Eurofins Genomics)., signal izločanja BiP in ustrezna 5' in 3' konca za od ligacije neodvisno kloniranje tega gena v ekspresijski vektor pMT na osnovi metalotioneinskega promotorja, modificiranega za selekcijo s puromicinom (pMT-puro).Vektor pMT-puro kodira mesto cepitve s trombinom, ki mu sledi 10x-His C-terminalna oznaka (slika S2).
Stabilna transfekcija vektorja SPACA6 pMT-puro v celice D. melanogaster S2 (Gibco) je bila izvedena podobno kot protokol, uporabljen za IZUMO1 in JUNO43.Celice S2 so bile odmrznjene in gojene v Schneiderjevem mediju (Gibco), dopolnjenem s končno koncentracijo 10 % (v/v) toplotno inaktiviranega fetalnega telečjega seruma (Gibco) in 1X antimikotičnega antibiotika (Gibco).Celice zgodnjega prehoda (3,0 x 106 celic) smo nasadili v posamezne vdolbinice plošč s 6 vdolbinami (Corning).Po 24 urah inkubacije pri 27 °C smo celice transfektirali z mešanico 2 mg vektorja SPACA6 pMT-puro in transfekcijskega reagenta Effectene (Qiagen) v skladu s protokolom proizvajalca.Transfektirane celice smo inkubirali 72 ur in nato pobrali s 6 mg/ml puromicina.Celice smo nato izolirali iz popolnega Schneiderjevega medija in jih dali v medij Insect-XPRESS brez seruma (Lonza) za proizvodnjo beljakovin v velikem obsegu.1 L šarža celične kulture S2 je bila gojena do 8–10 × 106 ml-1 celic v 2 L ventilirani polipropilenski erlenmajerici z ravnim dnom in nato sterilizirana s končno koncentracijo 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) in sterilno filtrirana.povzročeno.Inducirane kulture smo štiri dni inkubirali pri 27 °C pri 120 obratih na minuto.
Kondicionirani medij, ki je vseboval SPACA6, smo izolirali s centrifugiranjem pri 5660 × g pri 4 °C, čemur je sledil tangencialni pretočni filtrirni sistem Centramate (Pall Corp) z 10 kDa MWCO membrano.Nanesite koncentrirani medij, ki vsebuje SPACA6, na 2 ml kolono Ni-NTA agarozne smole (Qiagen).Ni-NTA smolo smo sprali z 10 volumni kolone (CV) pufra A in nato dodali 1 CV pufra A, da smo dobili končno koncentracijo imidazola 50 mM.SPACA6 smo eluirali z 10 ml pufra A, dopolnjenega z imidazolom, do končne koncentracije 500 mM.Trombin restrikcijskega razreda (Millipore Sigma) je bil dodan neposredno v dializno cevje (MWCO 12-14 kDa) pri 1 enoti na mg SPACA6 v primerjavi z 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 in 150 mM NaCl (pufer B) za dializo.) pri 4 °C 48 ur.S trombinom razcepljeni SPACA6 smo nato trikrat razredčili, da smo zmanjšali koncentracijo soli, in naložili na 1 ml MonoS 5/50 GL kationsko izmenjevalno kolono (Cytiva/GE), uravnoteženo z 10 mM Tris-HCl, pH 7,5.Kationski izmenjevalec smo sprali s 3 CV 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, nato smo SPACA6 eluirali z linearnim gradientom od 0 do 500 mM NaCl v 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 za 25 CV.Po ionsko izmenjevalni kromatografiji je bil SPACA6 koncentriran na 1 ml in izokratsko eluiran iz kolone ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad), uravnotežene s pufrom B. Glede na kromatogram združite in koncentrirajte frakcije, ki vsebujejo SPACA6.Čistost smo nadzorovali z elektroforezo, obarvano s Coomassie na 16 % SDS-poliakrilamidnem gelu.Koncentracijo beljakovin smo kvantificirali z absorbanco pri 280 nm z uporabo Beer-Lambertovega zakona in teoretičnega koeficienta molarne ekstinkcije.
Očiščen SPACA6 smo čez noč dializirali proti 10 mM natrijevega fosfata, pH 7,4 in 150 mM NaF in razredčili na 0,16 mg/mL pred analizo s CD spektroskopijo.Spektralno skeniranje CD-jev z valovno dolžino od 185 do 260 nm je bilo zbrano na spektropolarimetru Jasco J-1500 z uporabo kvarčnih kivet z dolžino optične poti 1 mm (Helma) pri 25 °C s hitrostjo 50 nm/min.Spektri CD so bili popravljeni na osnovni liniji, povprečeni v 10 pridobitvah in pretvorjeni v srednjo preostalo eliptičnost (θMRE) v stopinjah cm2/dmol:
kjer je MW molekulska masa vsakega vzorca v Da;N je število aminokislin;θ je eliptičnost v milistopinjah;d ustreza dolžini optične poti v cm;koncentracija beljakovin v enotah.