310 10*1mm navita cev iz nerjavečega jekla kemična komponenta, N-terminalne domene spidroina tvorijo hidrogele na osnovi amiloidnih fibril in zagotavljajo platformo za imobilizacijo beljakovin.

Hvala, ker ste obiskali Nature.com.Uporabljate različico brskalnika z omejeno podporo za CSS.Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju).Poleg tega, da zagotovimo stalno podporo, spletno mesto prikažemo brez slogov in JavaScripta.
Drsniki, ki prikazujejo tri članke na diapozitiv.Uporabite gumba za nazaj in naprej, da se premikate po diapozitivih, ali pa gumbe za krmiljenje diapozitivov na koncu, da se premikate po vsakem diapozitivu.

Specifikacija

310 dobaviteljev navitih cevi iz nerjavečega jekla 10*1 mm

Kemična sestava

Mehanske lastnosti

Rekombinantne beljakovine pajkove svile (proteini pajkove svile) imajo veliko potencialnih aplikacij pri razvoju novih biomaterialov, vendar jih je zaradi njihove večmodalne narave in narave, nagnjene k agregaciji, težko pridobiti in jih je enostavno uporabiti.Tukaj poročamo, da rekombinantni miniaturni spidroinski proteini in, kar je pomembno, sama N-terminalna domena (NT) hitro tvorijo samonosne in prozorne hidrogele pri 37 °C.fuzijski proteini, sestavljeni iz NT in zelenega fluorescenčnega proteina ali purinske nukleozidne fosforilaze, tvorijo popolnoma funkcionalne fuzijske proteine.Hidrogeli.Naši rezultati kažejo, da rekombinantni NT in fuzijski proteini zagotavljajo visoke izkoristke izražanja in dajejo hidrogelom privlačne lastnosti, kot so prosojnost, geliranje brez zamreženja in neposredna imobilizacija aktivnih proteinov pri visoki gostoti.
Pajki imajo kar sedem različnih sklopov svilenih žlez, od katerih vsaka proizvaja določeno vrsto svile.Vseh sedem vrst svile je sestavljenih iz proteinov pajkove svile (spidroinov), dolgih približno 6000 ostankov, in vsebujejo veliko osrednjo ponavljajočo se regijo, obdano s sferičnimi N- in C-terminalnimi domenami (NT in CT) 1,2.Najbolj razširjeno vrsto svile, primarno ampulo, proizvaja primarna ampulna žleza.V tej žlezi monosloj epitelijskih celic sintetizira proteine ​​spidroin in jih izloča v lumen žleze, kjer so prisotni v topni obliki (doping) v izjemno visokih koncentracijah (30–50 % w/v)3,4.Razpravljalo se je o organizaciji in konformaciji glavnih ampularnih spidroinskih proteinov v žlezi, vendar večina eksperimentalnih dokazov kaže na prisotnost na splošno spiralne in/ali naključne spiralne konformacije ter micelarne ali lamelarne strukture 5,6,7,8,9,10.Medtem ko ponavljajoče se domene uravnavajo mehanske lastnosti svilenih vlaken, ki tvorijo nanokristale β-listov in amorfne strukture 11, 12, 13, 14, 15, končne domene uravnavajo svilena vlakna kot odziv na spreminjajoče se pogoje vzdolž svilene žleze 16, 17, 18.Z nadzorom nastajanja svile so 19. terminalne domene evolucijsko ohranjene in njihova funkcija je lahko skupna vsem spidroinskim proteinom 2,20,21.Med prehodom skozi žlezo se pH spidroina zniža s približno 7,6 na < 5,716 in se poveča s striženjem in raztezanjem, ki ga posreduje gibanje skozi kanal, ki se postopoma oži.V raztopini je CT α-vijačni konstitutivni vzporedni dimer17, toda kot odziv na nizek pH in strižne sile se CT razvije in preklopi β-plasti16, 17, kar lahko sproži β-plasti v ponavljajočih se regijah Convert 16. NT so monomerne pod pogoji, ki odražajo razmere v lumnu žleze in posredujejo topnost spidroina, vendar pri znižanem pH protonacija številnih stranskih verig karboksilne kisline povzroči dimerizacijo NT s pKa približno 6,5, s čimer se stabilizira NT in fiksira spidroin v velikih količine.omrežja16,18.Tako ima NT ključno vlogo pri tvorbi filamentov, ki se spreminja iz monomera v prevleki v dimer v vlaknu 23, 24, 25.NT ostaja visoko topen in spiralen v vseh pogojih, ki so bili raziskani do danes 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, kar je navdihnilo njegov razvoj kot oznake za izboljšanje topnosti za proizvodnjo heterolognih proteinov.
Rekombinantni mini protein pajkove svile, sestavljen iz ene NT, ene kratke ponovitvene regije, enega CT in oznake His6 (His-NT2RepCT) za čiščenje, je tako topen v vodnem pufru kot naravni protein pajkove svile in posnema naravne pomembne značilnosti svilenega pajka .pokritost 25.31.His-NT2RepCT se lahko zvije v neprekinjena vlakna z uporabo biomimetičnega stroja, v katerem se topna prevleka pH 8 ekstrudira v vodno kopel pH 525,32,33,34,35.Bioreaktorska fermentacija E. coli, ki izraža His-NT2RepCT, in kasnejša naknadna obdelava sta po čiščenju povzročila izkoristek >14 g/L.Visok izkoristek, visoka topnost in ustrezen odziv His-NT2RepCT na kisle pogoje se pripisujejo NT23, 25, 34.
Tukaj poročamo o hitri tvorbi prozornih hidrogelov iz rekombinantnih spidroinskih proteinov, vključno s samim NT, z inkubacijo raztopine proteina pri 37 °C.Z uporabo fluorescence tioflavina T (ThT), infrardeče spektroskopije s Fourierjevo transformacijo (FTIR), spektroskopije z jedrsko magnetno resonanco (NMR) in transmisijske elektronske mikroskopije (TEM) smo ugotovili, da so proteini NT in mikropajka podvrženi strukturni transformaciji v β-listove in amiloidom podobna vlakna ko nastanejo geli.Poleg tega fuzijski proteini NT in zeleni fluorescentni protein (GFP) ali purin nukleozid fosforilaze (PNP) tvorijo hidrogele s popolnoma funkcionalnimi fuzijskimi fragmenti.Visoko zmogljivo izražanje v heterolognih gostiteljih, skupaj s hitro tvorbo hidrogelov v fizioloških pogojih, odpira možnost stroškovno učinkovite proizvodnje hidrogelov z inženirskimi funkcijami.
Za razliko od večine prijavljenih rekombinantnih spidroinskih proteinov36 je His-NT2RepCT stabilen v pufru Tris-HCl pri pH 8 in ga je mogoče koncentrirati do 500 mg/ml brez obarjanja25.Zato smo bili presenečeni, ko smo ugotovili, da ta protein hitro tvori optično čiste, samonosne hidrogele, ko ga inkubiramo pri 37 °C (sl. 1b-d).Nadaljnje študije so pokazale, da je do geliranja His-NT2RepCT prišlo v širokem razponu koncentracij beljakovin (10–300 mg/mL) in da je bila ta koncentracija v obratni korelaciji s časom geliranja (slika 1c in dopolnilna slika 1).Da bi ugotovili, kateri deli His-NT2RepCT posredujejo pri tvorbi hidrogela, smo nato pregledali vsako domeno posebej in v različnih kombinacijah s testom inverzije bučke (slika 1a,b).Vse testirane frakcije rekombinantnega spidroina so tvorile gele (pri koncentraciji proteina 300 mg/mL) v manj kot 1 uri, razen oborjenega 2Rep (slika 1b).To nakazuje, da lahko NT in CT sama, v kombinaciji ali povezana s ponovitvami, želirata pri 37 °C in da oznaka His6 ne vpliva na ta proces v kakršni koli pomembni meri.Glede na skupno predstavo, da je NT zelo topen in stabilen protein in da so prejšnja poročila o rekombinantnih spidroinskih hidrogelih pripisovala gelacijske učinke konformacijskim spremembam v ponavljajočih se regijah in/ali CT, bi NT sam lahko.Odkritje geliranja je bilo nepričakovano.Dodatna tabela 1) 37, 38, 39. Zanimivo je, da je NT že želiral v 10 minutah pri koncentraciji ≥ 300 mg/mL (slika 1c).Poskusi inverzije viale z različnimi koncentracijami NT so pokazali, da je pri >50 mg/mL raztopina NT želirala hitreje kot His-NT2RepCT pri ustrezni koncentraciji (m/v, slika 1c).
Shematska predstavitev različnih spidroinskih konstruktov, preučenih v tem delu.b Čas geliranja pri 37 °C za različne rekombinantne spidroinske proteine ​​(300 mg/mL), preverjen z obračanjem viale.CT gel takoj brez inkubacije (<300 mg/mL), 2Rep oborine (300 mg/mL, 5 mm skala).c Čas geliranja His-NT2RepCT in NT pri navedenih koncentracijah beljakovin pri 37 °C.d Fotografije His-NT2RepCT in NT hidrogelov s pajkom in črko »NT«, natisnjeno spodaj (obe 200 mg/mL, lestvica 5 mm).
Hidrogeli, ki jih tvorijo različni rekombinantni spidroinski proteini, imajo nekoliko drugačne barve, opazovanje s prostim očesom pa kaže različne stopnje preglednosti (slika 1b).NT geli so izjemno prozorni, drugi geli pa postanejo neprozorni.His-NT2RepCT in NT gele, ulite v cilindrične cevi, je bilo mogoče nedotaknjene odstraniti iz kalupa (slika 1d).
Da bi preizkusili, ali naravni premazi iz pajkove svile gelirajo pod pogoji, za katere je zdaj ugotovljeno, da povzročajo geliranje rekombinantnih proteinov spidroina, so bili premazi zbrani iz velike žleze ampule švedskega mostičastega pajka (Larinioides sclopetarius).Obloge so bile shranjene v 20 mM Tris-HCl pufru pri 50 mg/mL (na podlagi izmerjene suhe teže), vendar med 21-dnevno inkubacijo pri 37 °C niso opazili geliranja (dodatna slika 2a).
Za kvantificiranje teh gelov je mogoče uporabiti reološke meritve za preučevanje procesa geliranja in določitev splošnih mehanskih lastnosti.Zlasti spremljanje skladiščnega modula (elastičnosti) pri povišanih temperaturah lahko zagotovi informacije o temperaturi želiranja kot tudi o viskoelastičnih lastnostih prevleke.Poskusi dviga temperature (z uporabo 1 °C/min pri 25-45 °C, ki temeljijo na prejšnjih študijah z uporabo osnovnih raztopin naravne svile)40,41 so pokazali, da se moduli shranjevanja raztopin His-NT2RepCT in NT povečujejo z naraščajočo temperaturo.se je povečalo (slika 2 in dopolnilna slika 3).Predvsem je modul NT začel rasti pri nižji temperaturi v primerjavi s His-NT2RepCT, kar je skladno s hitrejšim časom geliranja, opaženim, ko je bil NT neposredno inkubiran s His-NT2RepCT pri 37 °C (slika 1).Po poznejšem padcu temperature se modul shranjevanja ni vrnil na nižje vrednosti in je ostal nad modulom izgube (glej dodatno sliko 3), kar kaže na toplotno ireverzibilno stabilno gelacijo.Po geliranju je končni modul elastičnosti znašal od 15 do 330 kPa za hidrogele His-NT2RepCT pri koncentraciji 100–500 mg/mL, končni modul elastičnosti za hidrogele NT (100–500 mg/mL) pa je bil v območju od 2 do 1400 kPa (sl. 2 in celotni podatki rampe) glejte dodatno sliko 3).
a Sprememba temperature med meritvami His-NT2RepCT (300 mg/mL) in b NT (300 mg/mL) s stresanjem.Puščice označujejo temperaturni trend, svetlejše senčenje podatkov modula za shranjevanje pa prikazuje testiranje pri nižjih vrednostih navora za instrument, kot jih je določil proizvajalec, kar je vzrok za povečan hrup.c Kopičenje His-NT2RepCT in NT na končnem modulu po povišani temperaturi (100, 300 in 500 mg/mL).Vsi odčitki modula se vzamejo pri frekvenci 0,1 Hz.
Kot potencialno metodo za raziskovanje konformacijskih sprememb, povezanih z geliranjem, smo posneli FTIR spektre His-NT2RepCT in NT pred in po geliranju pri 37 °C (slika 3a,b).Kot je bilo pričakovano, so spektri raztopin His-NT2RepCT in NT ustrezali proteinom, ki kažejo sekundarno strukturo α-vijačnice/naključne tuljave, z izrazitim pasom pri 1645 cm-1.Za oba hidrogela je geliranje povzročilo nastanek dveh krakov v srednjem I pasu pri približno 1617 cm-1 in 1695 cm-1 (sl. 3a, b), kar kaže na nastanek antiparalelnih struktur β-listov.Te spremembe so lahko jasno vidne tudi v ustreznem drugem derivatu in spektru geliranja razlike (dopolnilna slika 4b).Dva pasova NT β-sloja sta bila bolj izrazita kot pri His-NT2RepCT, kar kaže, da je bila skupna vsebnost pasov β-sloja v NT hidrogelu višja kot pri NT2RepCT hidrogelu.
a FTIR absorpcijski spekter His-NT2RepCT in b NT (oba 500 mg/mL) pred (raztopina) in po (gel) inkubaciji pri 37 °C.c TEM slike resuspendiranih 50 mg/ml NT2RepCT gelov in d NT.Lestvica 200 nm.e Premeri vlaken His-NT2RepCT in NT hidrogelov.n = 100 izmerjenih fibril, p < 0,0001.Vrstice napak prikazujejo standardno odstopanje.Središče vrstic napak je povprečje.Za statistično analizo je bil uporabljen neparni t-test (dvostranski).f ThT fluorescenca različnih rekombinantnih spidroinskih proteinov (100 mg/mL) pri 37 °C brez stresanja.g NT (100 mg/mL) poskusi inokulacije iz 100 mg/mL NT gela z 0 %, 5 %, 10 % in 20 % semen.
Analiza gela s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) je pokazala, da je hidrogel sestavljen iz amiloidu podobnih fibril (sliki 3c, 3d).NT-formirane fibrile so bile podolgovate (5–12 nm v premeru) in nerazvejane, medtem ko so bile His-NT2RepCT fibrile krajše po dolžini in bistveno širše v premeru (7–16 nm) (slika 3e).Ti rezultati so nam omogočili, da smo sledili kinetiki fibroze z uporabo testa tioflavina T (ThT).Za vse rekombinantne spidroinske proteine ​​se je fluorescentni signal povečal, ko so bili vzorci inkubirani pri 37 ° C (slika 3f, dopolnilna slika 5a).V skladu s to ugotovitvijo je mikroskopski pregled NT in His-NT2RepCT v pogojih želiranja razkril enakomerno povečanje fluorescence ThT brez opaznega lokalnega kopičenja ThT-pozitivnih agregatov (dopolnilna slika 5b, c).Nastajanja ThT-pozitivnih fibril ni spremljalo povečanje motnosti NT in His-NTCT (dodatna slika 5d), kar pomeni, da se lahko mreža fibril v gelu oblikuje brez ogrožanja jasnosti gela.Sejanje z dodajanjem majhnih količin predhodno oblikovanih fibril lahko znatno pospeši tvorbo fibril nekaterih amiloidov42, 43, 44, vendar dodajanje 5 %, 10 % ali 20 % (m/m) NT raztopini hidrokoagulantov NT.setveni učinek (slika 3g).Morda je to posledica dejstva, da so fibrili v hidrogelu relativno fiksni in jih ni mogoče uporabiti kot semena.
Nepričakovano obnašanje rekombinantnih spidroinskih proteinov pri visokih temperaturah je spodbudilo nadaljnje študije spektroskopije jedrske magnetne resonance (NMR) za identifikacijo konformacijskih sprememb, povezanih s tvorbo gela.NMR spektri raztopin His-NT2RepCT, posneti skozi čas pri 37 °C, so pokazali, da je CT še vedno delno zvit, medtem ko sta signala NT in 2Rep izginila (slika 4a), kar nakazuje, da sta predvsem NT in 2Rep delno nadzorovala tvorbo His- NT2RepCT hidrogel.Signal CT je bil tudi oslabljen na 20 % svoje prvotne intenzivnosti, kar kaže, da je tudi CT večinoma fiksiran in vključen v strukturo hidrogela.Pri manjšem delu CT, ki je tako gibljiv kot v predhodno inkubiranem vzorcu in tako opazovan z NMR raztopine, v spektrih manjkajo signali za prvih 10 strukturiranih ostankov, verjetno zaradi težke imobilizacije pritrjenega dela His-NT2Rep.NMR spektri -stanja hidrogelov -NT2RepCT so pokazali prevladujočo prisotnost α-vijačnic in β-slojev ter v manjši meri naključno konformacijo tuljave (slika 4b).Analiza kemijskega premika ostankov metionina, prisotnih samo v NT, je pokazala, da je bila ta domena pretvorjena v strukturo β-listov.Časovno odvisni spektri NT v raztopini so pokazali enakomerno zmanjšanje intenzitete signala (sl. 4c), NMR v trdnem stanju hidrogelov NT pa je pokazal, da je bila večina ostankov NT pretvorjenih v strukture β-listov (sl. 4d).Konformacije 2Rep ni bilo mogoče določiti ločeno zaradi njegove nagnjenosti k agregaciji.Vendar so bili NMR spektri trdnega stanja hidrogelov NTCT in His-NT2RepCT videti zelo podobni (slika 4b; dopolnilna slika 6b), kar kaže, da je 2Rep malo prispeval k strukturnemu delu hidrogela His-NT2RepCT.Za hidrogele CT je bilo ugotovljeno, da obstajajo α-vijačnice, β-listi in naključne vijačne sekundarne strukture (dopolnilna slika 6d).To nakazuje, da nekateri deli CT ostanejo α-vijačnice, drugi pa postanejo β-listi.Tako rezultati NMR spektroskopije kažejo, da je NT pomemben za tvorbo hidrogela in se tudi preoblikuje v konformacijo β-listov po fuziji z 2Rep in CT.V skladu s tem smo nedavno ugotovili, da se amiloidne prostorske zadrge verjetno oblikujejo v vseh petih vijačnicah domene NT, Waltzov algoritem pa je napovedal amiloidogeno regijo v vijačnici 1 (slika 4e).
2D spektri raztopine 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT pred (modro) in 19 ur po inkubaciji (rdeče) pri 37 °C.Posamezni navzkrižni vrhovi v rdečem spektru in F24, G136, polyA v modrem spektru so označeni z enočrkovnimi simboli aminokislin in številkami ostankov.Vložki prikazujejo odvisnost intenzitete signala od časa za izbrane ostanke iz domen NT, 2Rep in CT.b Radiofrekvenčni spektri v trdnem stanju (RFDR) hidrogelov His-NT2RepCT.Korelacije ostankov Cα/Cβ, opažene v spektrih RFDR, so bile določene s primerjavo z modelnimi kemijskimi premiki peptidov in vrednostmi, izpeljanimi iz statistike82,83 in njihovih sekundarnih struktur.SSB – vrtljivi stranski pas.c Enodimenzionalni spektri raztopine 15N-HSQC 10 mg/mL NT med inkubacijo pri 37 °C 36 ur.Vložek prikazuje volumetrično intenzivnost v odvisnosti od časa.d RFDR spektri trdnega stanja NT hidrogelov.Navedene so korelacije ostankov Cα/Cβ in njihovih sekundarnih struktur, opaženih v spektrih RFDR.e Na podlagi profila nagnjenosti k fibrilaciji NT45.79 iz baze podatkov Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Rosetta energija okna prostorskega premika strele heksapeptida je prikazana v kcal/mol.Rdeče črte označujejo heksapeptide z visoko nagnjenostjo k fibrozi (energija Rosetta pod -23 kcal/mol; pod črtkano črto).Zelene črte označujejo fragmente z energijo Rosetta nad pragom in je zato manj verjetno, da bodo tvorile sterične zadrge.Fragmenti, ki vsebujejo prolin, so bili izključeni iz analize (brez stolpcev).Kvadratki označujejo področja amiloidoze, ki jih predvideva Waltzov algoritem81 (https://waltz.switchlab.org).Zaporedje aminokislinskih ostankov NT je na vrhu, vrste ostankov, ki jih najdemo v sekundarni strukturi β (določeno z NMR spektroskopijo v trdnem stanju), pa so prikazane rdeče.Položaji petih NT α-vijačnic so označeni kot (H1-H5)28.
Pri pH <6,5 HT dimerizira in je odporen na denaturacijo, povzročeno s toploto ali sečnino18.Da bi razjasnili, kako dimerizacija in stabilnost NT vplivata na geliranje, smo raztopine, ki vsebujejo 100 mg/ml NT, kontrolirali pri pH 8, 7 in 6 s testom inverzije viale.Vzorci NT, inkubirani pri pH 8 in 7, so gelirali po 30 minutah pri 37 °C, vendar je gel pH 8 ostal bister, medtem ko je gel pH 7 pokazal vidno oborino (slika 5a).Nasprotno pa raztopina, ki je vsebovala HT pri pH 6, ni tvorila gela in po 20 minutah pri 37 °C je bilo mogoče videti veliko oborino.To nakazuje, da sami dimeri in/ali njihova večja stabilnost v primerjavi z monomeri preprečujejo geliranje.Tvorba oborine za NT pri pH 7 in 6 ni bila pričakovana, saj so poročali, da je NT topen pri 200 mg/ml27, se zlahka ponovno zvije po toplotni denaturaciji in tudi obdrži α-vijačnico pri nižjih vrednostih pH 18. Verjetna razlaga za ta odstopanja je, da so bili poskusi, o katerih so prej poročali, izvedeni pri sobni temperaturi ali nižji ali pri relativno nizkih koncentracijah beljakovin16,18,19.
Inverzijski test z NT vialo (100 mg/ml) pri pH 8, 7, 6 in 154 mM NaCl (pH 8) po inkubaciji pri 37 °C.b NT CD spektri s 154 mM NaF oziroma 154 mM NaCl in brez njega.Molarna eliptičnost pri 222 nm se pretvori v delež naravnih gub.c Inverzijski test NT (100 mg/mL) NT* (37 °C in 60 °C), NTA72R (37 °C) in His-NT-L6 (37 °C in 60 °C).d CD spektri NT mutantov NT*, NTA72R in His-NT-L6.Molarna eliptičnost pri 222 nm se pretvori v delež naravnih gub.e Inverzijski test NTFlSp, NTMiSp in zmanjšanega NTMiSp (100 mg/mL).Lestvica merila 5 mm.f CD spektri NT, NTFlSp, NTMiSp in zmanjšanega NTMiSp.Molarna eliptičnost pri 222 nm se pretvori v delež naravnih gub.Celotni spektri NT pri 25 °C in 95 °C so prikazani na dodatni sliki 8.
Fiziološka koncentracija soli določa elektrostatične interakcije med podenotami NT in dimerizacijo prenosa NT na nižji pH18.Ugotovili smo, da je prisotnost 154 mM NaCl in NaF dejansko zavirala geliranje (sl. 5a, b; dopolnilna slika 2b) in da so te soli povečale toplotno stabilnost monomerov NT (sl. 5b, dopolnilna slika 8) .Prav tako nakazuje, da izboljšanje stabilnosti namesto dimerizacije preprečuje tvorbo gela.
Za nadaljnje raziskovanje vloge dimerizacije in stabilnosti beljakovin pri geliranju smo uporabili dva mutanta, NT* in NTA72R, ki prav tako ostaneta monomerna pri nizkem pH 28,30.NT* je mutant z dvojnim obratom naboja, pri katerem je navidezna dipolarna porazdelitev naboja monomera sploščena, kar preprečuje dimerizacijo in drastično poveča stabilnost monomera.NTA72R je nabit dipol, toda Arg-substituirana Ala se nahaja na meji dimera, zato mutacije motijo ​​interakcije podenot, potrebne za dimerizacijo.Po inkubaciji pri 37 °C NT* ni tvoril hidrogela, medtem ko je NTA72R tvoril neprozoren gel 15 minut (slika 5c).Ker tako NT* kot NTA72R ne moreta dimerizirati, vendar se razlikujeta po stabilnosti monomera (slika 5d), ti rezultati močno kažejo, da visoka termodinamična stabilnost preprečuje želiranje NT.To podpira tudi dejstvo, da HT* tvori gel, ko je nestabilen pri visoki temperaturi (po 8 minutah pri 60 °C; slika 5c).Prej je bilo dokazano, da visoka vsebnost metionina v NT utekočini njegovo naravno zvijanje in da šest nadomestkov Met v Leu (tukaj imenovanih His-NT-L6) močno stabilizira monomer NT46.Na podlagi predpostavke, da je za tvorbo gela NT potrebna strukturna prožnost, smo ugotovili, da stabilni mutant His-NT-L6 ni gel pri 37 °C (slika 5c, d).Vendar pa je tudi His-NT-L6 tvoril gel po 60-minutni inkubaciji pri 60°С (slika 5c).
Zdi se, da sposobnost NT, da se preoblikuje v strukture β-listov in tvori hidrogele, velja za nekatere, a ne za vse domene NT spidroina.NT iz različnih vrst svile in vrst pajkov, Trichonephila clavipes (NTFlSp), so tvorili gele kljub relativno nizki vsebnosti metionina in visoki toplotni stabilnosti (sl. 5e, f in dodatna tabela 2).V nasprotju s tem NT iz majhnega ampularnega proteina spidroina iz Araneus ventricosus (NTMiSp) z nizko toplotno stabilnostjo in visoko vsebnostjo metionina ni tvoril hidrogelov (dodatna tabela 2 in slika 5e, f).Slednje je lahko povezano s prisotnostjo intramolekularnih disulfidnih vezi 29, 47.Dosledno, ko so bile disulfidne vezi NTMiSp reducirane, je po inkubaciji pri 37 °C 10 minut tvoril hidrogel (sl. 5e).Na koncu je treba opozoriti, da je strukturna prožnost pomemben, vendar ne edini kriterij za nastanek gela iz NT.Drug dejavnik, ki je lahko pomemben, je nagnjenost k tvorbi amiloidnih fibril, analiza z bazo podatkov zadrge in algoritmom Waltz pa je pokazala korelacijo med sposobnostjo tvorbe gelov in prisotnostjo amiloidogenih regij ter obsegom predvidenih regij da tvorijo sterične zadrge.Obstajala je korelacija (dodatna tabela 2 in dopolnilna slika 9).
Sposobnost NT, da tvori fibrile in tvori gele pod ugodnimi pogoji, nas je pripeljala do hipoteze, da lahko fuzije NT z drugimi proteinskimi fragmenti še vedno tvorijo gele s polno funkcijo fuzijskih partnerjev.Da bi to preizkusili, smo uvedli zeleni fluorescentni protein (GFP) in purin nukleozidno fosforilazo (PNP) na C-koncu NT.Nastali fuzijski proteini so bili izraženi v E. coli z zelo visokimi končnimi donosi (150 mg/L in 256 mg/L kultur v stresalni bučki za His-NT-GFP oziroma His-NT-PNP), skladno s tem, kar je bilo prikazano za druge proteine, spojene z NT Ref.30. Fuzijski proteini His-NT-GFP (300 mg/mL) in His-NT-PNP (100 mg/mL) so tvorili gele po 2 urah in 6,5 urah pri 37 °C in, kar je pomembno, frakcija GFP je ostala nespremenjena.opazili po geliranju, pri čemer > 70 % začetne intenzivnosti fluorescence ostane po geliranju (slika 6a).Za merjenje aktivnosti PNP v raztopinah in gelih his-NT-PNP smo morali razredčiti fuzijski protein z NT, ker je bila encimska aktivnost čistega pripravka izven območja detekcije testa pri koncentracijah želiranja.Gel, oblikovan z mešanico, ki vsebuje 0,01 mg/mL His-NT-PNP in 100 mg/mL NT, je ohranil 65 % začetne encimske aktivnosti predinkubiranih vzorcev (slika 6b).Gel je med meritvijo ostal nedotaknjen (dodatna slika 10).
a Relativna intenzivnost fluorescence pred in po geliranju His-NT-GFP (300 mg/mL) in obrnjene viale, ki vsebuje His-NT-GFP hidrogel (300 mg/mL) pod vidno in UV svetlobo.Točke prikazujejo posamezne meritve (n = 3), stolpci napak prikazujejo standardni odklon.Povprečna vrednost je prikazana na sredini vrstic napak.b Aktivnost PNP je bila pridobljena s fluorometrično analizo z uporabo raztopin in gelov, sestavljenih iz NT (100 mg/ml) in mešanice, ki vsebuje 0,01 mg/ml his-NT-PNP in 100 mg/ml novih tajvanskih dolarjev.Vložek prikazuje obrnjeno vialo, ki vsebuje hidrogel, ki vsebuje His-NT-PNP (5 mm lestvica).
Tukaj poročamo o nastanku hidrogelov iz NT in drugih rekombinantnih spidroinskih proteinov z inkubacijo beljakovinske raztopine pri 37 °C (slika 1).Pokazali smo, da je geliranje povezano s transformacijo α-vijačnic v β-plasti in tvorbo amiloidu podobnih fibril (sliki 3 in 4).Ta ugotovitev je presenetljiva, saj so NT zviti kroglasti snopi s petimi vijačnicami, znani po izjemno visoki topnosti in visoki stabilnosti pri koncentracijah > 200 mg/mL pri 4 °C več dni27.Poleg tega se NT zlahka ponovno zvijejo po toplotni denaturaciji pri nizkih koncentracijah beljakovin v µM.Po naših rezultatih je za tvorbo fibril potrebna kombinacija koncentracije beljakovin >10 mg/mL in rahlo povišane temperature (slika 1).To je skladno z idejo, da lahko amiloidne fibrile nastanejo iz globularno zvitih proteinov, ki so v delno razvitem stanju zaradi toplotnih nihanj v fizioloških pogojih 48 .Primeri beljakovin, ki so podvržene tej pretvorbi, vključujejo insulin 49, 50, β2-mikroglobulin, transtiretin in lizocim 51, 52, 53.Čeprav je NT v naravnem stanju α-vijačnica, je približno 65 % polipeptidne verige združljivega s sterično tvorbo zadrge (slika 4e) 45 .Ker je monomer dinamično mobilen46, lahko izpostavi te potencialne amiloidogene regije pri zmerno povišanih temperaturah in pri visokih koncentracijah celotnega proteina lahko doseže kritično koncentracijo za tvorbo amiloidnih fibril54.Po tem sklepanju smo ugotovili negativno korelacijo med koncentracijo spidroina in časom geliranja (slika 1c), in če je monomerna konformacija NT stabilizirana z mutacijami (NT*, His-NT-L6) ali z dodatkom soli, lahko prepreči nastajanje hidrogelov (slika 5).
V večini primerov amiloidne fibrile izginejo iz raztopine kot oborina, vendar pod določenimi pogoji lahko tvorijo hidrogele55,56,57.Fibrile, ki tvorijo hidrogel, imajo običajno visoko razmerje stranic in tvorijo stabilne tridimenzionalne mreže z molekularnim prepletanjem, 55, 58 v skladu z našimi rezultati.Za tvorbo hidrogela in vitro se proteini pogosto popolnoma ali delno razvijejo, na primer z izpostavljenostjo organskim topilom, visoki temperaturi (70–90 °C) in/ali nizkemu pH (1,5–3,0) 59,60,61,62.Spidroin hidrogeli, opisani tukaj, ne zahtevajo grobe obdelave, niti ne potrebujejo zamreževalnih sredstev za stabilizacijo hidrogelov.
Prej so poročali, da ponovitve spidroina in QD, za katere se zdi, da so podvržene preklapljanju β-listov med predenjem svile, tvorijo hidrogele.V primerjavi z našimi ugotovitvami so bili inkubacijski časi in/ali inkubacijske temperature bistveno daljši oziroma višji, nastali hidrogeli pa so bili pogosto neprozorni (slika 7 in dodatna tabela 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Poleg hitrega geliranja so NT hidrogeli >300 mg/mL (30 %) prekašali vse druge opisane rekombinantne hidrogele beljakovin pajkove svile, pa tudi naravne hidrogele, kot so želatina, alginat (2 %), agar (0,5 % ) in kolagen.(0,6 %) (slika 7 in dodatni tabeli 1 in 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Čas geliranja in modul elastičnosti hidrogelov v tej študiji so primerjali z drugimi hidrogeli na osnovi spidroina in izbranimi naravnimi hidrogeli.Reference so podane skupaj z opisom pogojev geliranja.APS Amonijev persulfat, sobna temperatura.Podatki 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Zdi se, da so pajki razvili načine za preprečevanje želiranja spidroina med shranjevanjem.Kljub visoki koncentraciji beljakovin v svileni žlezi velika ponavljajoča se regija, povezana s končno domeno, pomeni, da navidezna koncentracija NT in CT v žlezi ustreza približno 10-20 mg/ml na meji te študije.potreben za in vitro opaženo tvorbo hidrogela.Poleg tega so podobne koncentracije soli 16 stabilizirale NT, kot v svilenih žlezah (slika 5b).Konformacijo NT so preučevali v citosolu E. coli in ugotovili, da je tesneje zvita kot pri pregledu in vitro, kar dodatno kaže, da sol ali drugi dejavniki preprečujejo njeno agregacijo in vivo.Vendar pa je sposobnost NT, da se preoblikujejo v fibrile β-listov, lahko pomembna za tvorbo filamentov in jo je treba raziskati v prihodnjih študijah.
Poleg novih vidikov tvorbe fibril in hidrogelov, podobnih NT-amiloidu, ki smo jih opazili v tej študiji, smo tudi pokazali, da ima ta pojav lahko biotehnološke in biomedicinske aplikacije (slika 8).Kot dokaz koncepta smo združili NT z GFP ali PNP in pokazali, da fuzijski protein tvori tudi hidrogele, ko je inkubiran pri 37 °C in da frakcije GFP in PNP večinoma ohranijo svojo aktivnost po geliranju (slika 6).Nukleozidne fosforilaze so pomembni katalizatorji sinteze nukleozidnih analogov75, zaradi česar je naše odkritje pomembno za biofarmacevtsko industrijo.Koncept izražanja fuzijskih proteinov, ki tvorijo prozorne hidrogele pod ugodnimi pogoji, omogoča ustvarjanje funkcionaliziranih hidrogelov z ugodnimi lastnostmi za širok spekter aplikacij, kot je imobilizacija encimov, nadzorovano sproščanje zdravil in tkivno inženirstvo.Poleg tega sta NT in NT * učinkovita ekspresijska markerja30, kar pomeni, da se lahko NT in njegove različice uporabljajo za visoko zmogljivo proizvodnjo topnih fuzijskih proteinov in kasnejše ustvarjanje imobiliziranih ciljnih proteinov v 3D hidrogelih.
NT je topen, α-vijačen in stabilen pri nizkih koncentracijah (µM) in 37 °C.Pri enaki temperaturi, vendar pri naraščajočih koncentracijah (>10 mg/ml), NT tvori gele, sestavljene iz amiloidu podobnih fibril.NT fuzijski proteini tvorijo tudi fibrilarne gele s popolnoma funkcionalnimi fuzijskimi fragmenti, kar omogoča imobilizacijo različnih proteinov v 3D hidrogelih z uporabo NT.Spodaj: NT (PDB: 4FBS) in ilustracije omrežij vlaken in povezanih proteinskih struktur (predpostavljeno in nenarisano v merilu, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Konstrukte (glej dodatno tabelo 4 za popoln seznam, vključno z aminokislinskimi sekvencami) smo klonirali v plazmid pT7 in transformirali v E. coli BL21 (DE3).E. coli, ki je vsebovala konstruirane plazmide, je bila inokulirana v bujon Luria, dopolnjen s kanamicinom (70 mg/l) in gojila čez noč pri 30 °C in 250 obratih na minuto.Kulturo smo nato inokulirali 1/100 v medij LB, ki je vseboval kanamicin, in gojili pri 30 °C in 110 obratih na minuto, dokler OD600 ni dosegel 0,8.Za študije NMR so bile bakterije gojene v minimalnem mediju M9, ki je vseboval 2 g D-glukoze 13C (Aldrich) in 1 g amonijevega klorida 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) za označevanje beljakovin z izotopi.Znižajte temperaturo na 20 stopinj Celzija in inducirajte izražanje beljakovin z 0,15 mM izopropiltiogalaktopiranozida (končna koncentracija).Po ekspresiji beljakovin preko noči smo celice pobrali pri 7278 × g, 4 ° C 20 minut.Celične pelete smo resuspendirali v 20 mM Tris-HCl, pH 8, in zamrznili do nadaljnje uporabe.Odmrznjene celice so bile lizirane z uporabo celičnega motilca (stroji serije TS, Constant Systems Limited, Anglija) pri 30 kPa.Nato smo lizate centrifugirali pri 25.000 g 30 minut pri 4 °C.Za NTMiSp smo peleto nato resuspendirali v 2 M sečnini, 20 mM Tris-HCl, pH 8 in 2 minuti obdelovali z ultrazvokom (2 s vklop/izklop, 65 %), nato ponovno centrifugirali pri 25.000 xg, 4 °C znotraj 30 min.Supernatant smo naložili na kolono Ni-NTA, sprali z 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazola, pH 8, in končno protein eluirali z 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazola, pH 8. Da bi ustvarili NT2RepCT in NTCT, razgradnja trombina uvede mesto (ThrCleav) med His in NT.Mesta cepitve trombina so prisotna tudi v His-NT-ThrCleav-2Rep (proizvaja 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (proizvaja NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (proizvaja CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (proizvaja NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (proizvaja NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (proizvaja NTF1Sp) in His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (proizvaja NTMiSp).Konstrukte smo razgradili s trombinom (1:1000) in dializirali čez noč pri 4°C z 20 mM Tris-HCl, pH 8, z uporabo dializne membrane Spectra/Por s pragom molekulske mase 6-8 kDa.Po dializi se raztopina naloži na kolono Ni-NTA in zbere se efluent, ki vsebuje protein, ki nas zanima.Koncentracije beljakovin so bile določene z merjenjem UV absorbance pri 280 nm z uporabo koeficienta ekstinkcije vsakega proteina, razen za NTF1Sp, ki je uporabil Bradfordov test v skladu s protokolom proizvajalca.Čistost je bila določena z elektroforezo v gelu SDS poliakrilamida (4–20 %) in barvanjem s Coomassie briljantno modrim.Beljakovine smo koncentrirali z uporabo centrifugalnih filtrov (VivaSpin 20, GE Healthcare) pri 4000 x g z mejno vrednostjo molekulske mase 10 kDa v 20-minutnih ciklih.
Raztopino beljakovin odmrznite in previdno pipetirajte 150 µl v 1 ml prozorno vialo s pregrado (8 x 40 mm Thermo Scientific).Epruvete so bile zaprte in zaprte s parafilmom, da se prepreči izhlapevanje.Vzorci (n = 3) so bili inkubirani pri 37 °C ali 60 °C in občasno obrnjeni za opazovanje geliranja.Vzorce, ki niso želirali, smo inkubirali vsaj en teden.Zmanjšajte disulfidne vezi NTMiSp z 10 mM DTT na 10 µM proteina.Za analizo geliranja naravnih prevlek iz pajkove svile smo švedskega mostičastega pajka prerezali, dve glavni ampulirani žlezi dali v 200 μl 20 mM Tris-HCl pufra pH 8 in razrezali, da se je prevleka ločila od žlez..Vsebina žlez se raztopi v pufru, 50 µl za določanje suhe teže (z inkubacijo odprtih vial pri 60 °C do konstantne teže) in 150 µl za geliranje pri 37 °C.
Merilna geometrija/orodje je izdelano iz nerjavečega jekla z uporabo vzporedne plošče z zgornjim premerom 20 mm in razmikom 0,5 mm.Vzorec segrejte s 25 °C na 45 °C in nazaj na 25 °C s hitrostjo 1 °C na minuto z uporabo Peltierjeve plošče iz nerjavečega jekla.Meritve vibracij so bile izvedene pri frekvenci 0,1 Hz in v linearnem viskoelastičnem območju materiala pri deformaciji 5 % oziroma 0,5 % za vzorce 100 mg/mL oziroma 300–500 mg/mL.Uporabite vlažno komoro po meri, da preprečite izhlapevanje.Podatki so bili analizirani s programom Prism 9.
Za zbiranje infrardečih (IR) spektrov pri sobni temperaturi od 800 do 3900 cm–1.Naprava ATR, kot tudi pot svetlobe skozi spektrometer, se pred in med poskusom prečisti s suhim filtriranim zrakom.Raztopine (500 mg/mL za zmanjšanje vrhov absorpcije vode v spektrih) so bile pipetirane na kristale in geli (500 mg/mL) so bili oblikovani pred merjenjem in nato preneseni v kristale (n = 3).Posnetih je bilo 1000 skeniranj z ločljivostjo 2 cm-1 in ničelnim delovnim ciklom 2. Drugi derivat je bil izračunan z uporabo OPUS (Bruker) z uporabo gladilnega območja devetih točk.Spektri so bili normalizirani na isto integracijsko območje med 1720 in 1580 cm-1 z uporabo F. Mengesa »Spectragryph – Optical Spectroscopy Software«.Pri spektroskopiji ATR-IR je globina prodiranja infrardečega žarka v vzorec odvisna od valovnega števila, kar povzroči močnejšo absorpcijo pri nižjih valovnih številih kot pri višjih valovnih številih.Ti učinki niso bili popravljeni za spektre, prikazane na sl.3, ker so zelo majhne (dodatna slika 4).Popravljeni spektri za to sliko so bili izračunani s programsko opremo Bruker OPUS.
Načeloma je celovita kvantifikacija proteinskih konformacij mogoča po zanesljivi dekonvoluciji komponent znotraj vrha amida I.Vendar se v praksi pojavljajo nekatere ovire.Šum v spektru se lahko pojavi kot (lažni) vrhovi med dekonvolucijo.Poleg tega vrh zaradi upogibanja vode sovpada s položajem vrha amida I in ima lahko podobno velikost za vzorce, ki vsebujejo veliko količino vode, kot je tukaj proučeni vodni gel.Zato nismo poskušali popolnoma razgraditi vrha amida I, naša opažanja pa je treba upoštevati le kot podporo drugim metodam, kot je NMR spektroskopija.
Raztopini 50 mg/ml NT in His-NT2RepCT smo gelirali čez noč pri 37 °C.Hidrogel nato razredčimo z 20 mM Tris-HCl (pH 8) do koncentracije 12,5 mg/ml, dobro pretresemo in pipetiramo, da razbijemo gel.Nato smo hidrogel 10-krat razredčili z 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl vzorca smo nanesli na bakreno mrežo, prevlečeno s formvarjem, in presežek vzorca odstranili s pivalnim papirjem.Vzorci so bili dvakrat sprani s 5 µl vode MilliQ in obarvani z 1% uranil formatom 5 minut.Odvečni madež odstranite z vpojnim papirjem, nato mrežico posušite na zraku.Slikanje je bilo izvedeno na teh mrežah z uporabo FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN, ki deluje pri 100 kV.Slike so bile posnete pri povečavah x 26.500 in x 43.000 z uporabo kamere Veleta 2k × 2k CCD (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Nemčija).Za vsak vzorec (n = 1) je bilo posnetih 10–15 slik.Za analizo slike in merjenje premera vlaken (n = 100, različna vlakna) smo uporabili ImageJ (https://imagej.nih.gov/).Prizma 9 je bila uporabljena za izvedbo neparnih t-testov (dvostranski).Povprečna vrednost vlaken His-NT2RepCT in NT je bila 11,43 (SD 2,035) oziroma 7,67 (SD 1,389) nm.Interval zaupanja (95 %) je od -4,246 do -3,275.prostostne stopinje = 198, p < 0,0001.
80 µl tekočih vzorcev, ki so vsebovali 10 µM tioflavina T (ThT), smo izmerili v treh izvodih (n = 3) pod statičnimi pogoji z uporabo Corning plošč s črnim dnom s prozornim dnom s 96 vdolbinicami (Corning Glass 3881, ZDA).Fluorescenčne razlike so bile zabeležene z uporabo 440 nm vzbujalnega filtra in 480 nm emisijskega filtra (FLUOStar Galaxy iz BMG Labtech, Offenburg, Nemčija).Signal ThT ni bil niti nasičen niti ugasnjen, saj so bili poskusi z različnimi koncentracijami ThT izvedeni brez spreminjanja intenzitete signala.Za merjenje motnosti zabeležite absorbanco pri 360 nm.Za poskuse sejanja so 100 mg/mL gele oblikovali pri 37 °C, jih resuspendirali in uporabili za cepljenje pri molskih razmerjih 5 %, 10 % in 20 %.Podatki so bili analizirani s programom Prism 9.
Odtalite zaloge His-NT2RepCT in NT >100 mg/mL na ledu in filtrirajte skozi 0,22 µm filter.Koncentracije so bile izračunane z merjenjem absorbance pri 280 nm z uporabo Nanodrop.V vdolbinicah črne plošče brez vezave s 96 vdolbinicami (Corning) s prozornim dnom so bili vzorci razredčeni na 20 mg/ml v 20 mM Tris-HCl pH 8 in zmešani s 5 μM ThT (končna koncentracija), skupna koncentracija vzorca 50 μl volumna.Vzorci so bili slikani vsakih 10 minut pri 37 °C na mikroskopu CellObserver (Zeiss) s kanalom za prepustno svetlobo in kompleti filtrov za vzbujanje in emisijo FITC za slikanje THT.Za slikanje se uporablja objektiv 20x/0,4.Za analizo slik sta bila uporabljena Zen Blue (Zeiss) in ImageJ (https://imagej.nih.gov/).Gele smo pripravili tudi iz raztopin NT in His-NT2RepCT v koncentraciji 50 mg/mL, ki so vsebovale 20 mM Tris pH 8 in 5 µM ThT, in jih inkubirali pri 37 °C 90 minut.Koščke gela smo prenesli v novo vdolbinico, ki je vsebovala 20 mM Tris, pH 8 in 5 μM ThT v neobvezujoči črni plošči s prozornim dnom s 96 vdolbinicami.Pridobite slike zelene fluorescence in svetlega polja pri 20x/0,4 povečavi.ImageJ je bil uporabljen za analizo slike.
NMR spektri raztopine so bili pridobljeni pri 310 K na 600 MHz Bruker Avance Neo spektrometru, opremljenem s QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).Vzorci NMR, ki vsebujejo 10 mg/mL homogenega proteina, označenega s 13C, 15N, raztopljenega v 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02 % (m/v) NaN3, 5 % DO (v/v), (n = 1) .Kemični premiki NT2RepCT pri pH 6,7 so bili uporabljeni za dodelitev vrha 23 v 2D spektru 15N-HSQC.
Spektri trdne NMR (MAS) z vrtečim se magičnim kotom 13C, 15N-označenih hidrogelov so bili posneti na spektrometru Bruker Avance III HD pri 800 MHz, opremljenem s 3,2 mm 13C/15N{1H} brezelektronsko sondo.Temperaturo vzorca smo nadzorovali s plinskim tokom s spremenljivo temperaturo pri 277 K. Spektri dvodimenzionalne dipolne rotacijske resonance (DARR)76 in radiofrekvenčne ponovne povezave (RFDR)77 so bili pridobljeni pri frekvencah MAS 12,5 kHz oziroma 20 kHz.Navzkrižna polarizacija (CP) od 1H do 13C je bila izvedena z uporabo linearne rampe od 60,0 do 48,0 kHz pri 1H, 61,3/71,6 kHz pri 13C (pri 12,5/20 kHz MAS) in kontaktnega časa 0,5–1 ms.Med zbiranjem podatkov je bilo uporabljeno ločevanje Spinal6478 pri 73, 5 kHz.Čas pridobivanja je bil 10 milisekund, zakasnitev cikla pa 2,5 sekunde.Enopovezane korelacije Cα/Cβ, opažene v spektrih RFDR, so bile dodeljene na podlagi značilnih kemijskih premikov tipa ostankov in večpovezanih korelacij v spektrih DARR.
Podatkovna baza Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) je bila uporabljena za ovrednotenje tendenc plapolanja in energije Rosetta za NT, NTFlSp in NTMiSp.Baza podatkov Zipper izračunava Rosetta Energy80, ki združuje več funkcij proste energije za modeliranje in analizo strukture beljakovin.Raven energije -23 kcal/mol ali manj kaže na visoko nagnjenost k fibrilaciji.Nižja energija pomeni večjo stabilnost obeh β-verig v konformaciji zadrge.Poleg tega je bil Waltzov algoritem uporabljen za napovedovanje amiloidogenih regij v NT, NTFlSp in NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Raztopino NT proteina smo zmešali s pufrom 2-(N-morfolino)etansulfonske kisline (MES) pri pH 5,5 in 6,0, da smo pH znižali na pH 6 oziroma 7.Končna koncentracija beljakovin je bila 100 mg/ml.
Meritve smo izvajali na spektrometru J-1500 CD (JASCO, ZDA) s 300 μL kiveto z optično potjo 0,1 cm.Beljakovine smo razredčili na 10 μM (n = 1) v 20 mM fosfatnem pufru (pH 8).Za analizo stabilnosti beljakovin v prisotnosti soli smo analizirali beljakovine pri enaki koncentraciji (n = 1) v 20 mM fosfatnem pufru (pH 8), ki je vseboval 154 mM NaF oziroma NaCl.Temperaturni pregledi so bili zabeleženi pri 222 nm od 25 °C do 95 °C s hitrostjo segrevanja 1 °C/min.Delež nativno zvitih proteinov smo izračunali po formuli (KDmera – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Poleg tega je bilo za vsak vzorec posnetih pet spektrov od 260 nm do 190 nm pri 25 °C in po segrevanju na 95 °C.Pet spektrov je bilo povprečeno, zglajeno in pretvorjeno v molsko eliptičnost.Podatki so bili analizirani s programom Prism 9.
Intenzivnost fluorescence His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) je bila izmerjena v treh izvodih (n = 3) v ploščah Corning s 96 vdolbinicami s črnim prozornim dnom (Corning Glass 3881, ZDA) v statičnih pogojih.Izmerite vzorce s fluorescenčnim bralnikom plošč z vzbujevalno valovno dolžino 395 nm in zabeležite emisijo pri 509 nm pred geliranjem in 2 uri pozneje pri 37 °C.Podatki so bili analizirani s Prism 9.
Komplet za testiranje aktivnosti purinske nukleozidne fosforilaze (fluorometrična metoda, Sigma Aldrich) je bil uporabljen v skladu z navodili proizvajalca.Za merjenje aktivnosti v gelih in raztopinah, ki vsebujejo His-NT-PNP, zmešajte 10 ng His-NT-PNP s 100 mg/mL NT do skupne prostornine 2 µL, ker je gel dal signal nad intervalom zaznavanja niza.Vključene so bile kontrole za gele in raztopine brez His-NT-PNP.Meritve smo izvedli dvakrat (n = 2).Ko smo izmerili aktivnost, smo reakcijsko mešanico odstranili in gel fotografirali, da smo zagotovili, da je gel med meritvijo ostal nedotaknjen.Podatki so bili analizirani s programom Prism 9.
Za več informacij o zasnovi študije glejte povzetek študije Nature, povezan s tem člankom.
Sliki 1 in 2 prikazujeta začetne podatke.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f in 6, dodatne slike.3, dodatna sl.5a, d, dodatna sl.6 in dodatna sl.8. Podatki Podatki iz te študije gostujejo v zbirki podatkov Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Podatki NMR, pridobljeni v tej študiji, so bili objavljeni v repozitoriju BMRBig pod ID vnosa bmrbig36.Strukture GFP in PNP so bile vzete iz PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. in Johansson, J. Predenje umetne pajkove svile.National Chemical.biologija.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Genom Nephila clavipes poudarja raznolikost genov za pajkovo svilo in njihovo kompleksno izražanje.National Genette.49, 895–903 (2017).