347 Kemična komponenta cevi iz nerjavečega jekla, identifikacija novih interferonskih odzivnih človeških levkocitnih antigen-A (HLA-A) kaperonskih beljakovin z uporabo navzkrižne masne spektrometrije (CLM)

Hvala, ker ste obiskali Nature.com.Uporabljate različico brskalnika z omejeno podporo za CSS.Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju).Poleg tega, da zagotovimo stalno podporo, spletno mesto prikažemo brez slogov in JavaScripta.
Drsniki, ki prikazujejo tri članke na diapozitiv.Uporabite gumba za nazaj in naprej, da se premikate po diapozitivih, ali pa gumbe za krmiljenje diapozitivov na koncu, da se premikate po vsakem diapozitivu.

Opis izdelka

Zvitke iz nerjavečega jekla 347L, razred jekla: SS347L

Signalni sistem interferona povzroči močan odziv citokina na širok razpon patogenih in intrinzičnih patoloških signalov iz okolja, kar ima za posledico indukcijo podskupin interferonskih inducibilnih beljakovin.Za odkrivanje novih interakcij beljakovin in beljakovin v domeni interferonskih beljakovin smo uporabili DSS-posredovano masno spektrometrijo (CLM).Poleg pričakovanih beljakovin, ki jih povzročajo interferon, smo identificirali tudi nove medmolekularne in intramolekularne navzkrižno povezane adukte kanoničnih interferonskih beljakovin, kot so MX1, USP18, OAS3 in STAT1.Osredotočili smo se na ortogonalno validacijo novega niza interferonskih beljakovinskih mrež, ki jih tvorijo HLA-A proteini (H2BFS-HLA-A-HMGA1) z uporabo koi-imunoprecipitacije in njihove nadaljnje študije z uporabo modeliranja molekularne dinamike.Modeliranje konformacijske dinamike beljakovinskega kompleksa je razkrilo več interakcijskih mest, ki so odražale interakcije, opredeljene v ugotovitvah CLMS.Skupaj predstavljamo pilotno študijo CLM -jev za prepoznavanje novih signalnih kompleksov, ki jih povzroči interferon, in se veselimo širše uporabe CLM -je za prepoznavanje nove dinamike interakcij beljakovin v mikrookolju tumorja.
Preden se začne prilagodljivi imunski odziv, gostiteljski prirojeni obrambni sistem namesti protimikrobni odziv, ki ga posreduje družina izločenih alfa-spiralnih citokinov, imenovanih interferoni (IFN).Razredi IFN tipa I IFNα in IFNβ aktivirata celične odzive, vključno z antivirusnimi, proapoptotičnimi, vnetnimi in antiproliferativnimi stanji.Pri ljudeh je znanih 13 podtipov IFNα, vse skupaj na kromosomu 91. Presenetljivo je bilo, da je bilo za klinično uporabo preučeno le IFNα2.V zadnjem času je bila posebna pozornost namenjena raziskovanju drugih podtipov IFNα.Nedavna študija je pokazala, da je IFNα14 ena najučinkovitejših izoform pri omejevanju podvajanja HBV2 in HIV-13,4 v primerjavi s kanoničnim podtipom IFNα2.
Ugotovljeno je bilo, da aktivirani receptorski kompleksi interferona tipa I (IFNAR1 in IFNAR2) sprožijo kaskado transdukcije signala, ki sta ga posredovala Janus Kinases Tyk2 in JAK15,6.Te Janus kinaze fosforilatne signalne pretvornike in transkripcijske beljakovinske aktivatorje (STAT1 in STAT2) na ostankih tirozina, da sprožijo heterodimerizacijo, ki jo posreduje domena SH2.Nato IRF9 veže heterodimere STAT, da tvori trimerni kompleks gena, stimuliranega s faktorjem IFN (ISGF3), ki prehaja v jedro in povzroči transkripcijo več kot 2000 interferonskih genov (ISGS) 5,6,7,8.
ISG -ji tvorijo hrbtenico prirojenega imunskega sistema, zlasti kot odziv na virusni napad.Kot prva obramba pred virusno okužbo celice hitro uporabijo obsežne interakcije celičnih beljakovin s široko paleto bioloških aktivnosti.Ti proteini vključujejo receptorje za prepoznavanje vzorcev, signalne molekule, transkripcijske faktorje in beljakovine z neposrednimi protivirusnimi funkcijami ter negativne regulatorje imunskih odzivov9.Večina informacij o aktivnosti ISG izvira iz funkcionalnih zaslonov z uporabo prekomernih zaslonov 10,11 ali tehnik utišanja genov (siRNA, RNAi in CRISPR) 12,13, pri katerih se posamezni ISG izražajo ali zavirajo, njihova aktivnost pa se testira na različnih virusih.Čeprav so te študije določile protivirusne lastnosti posameznih ISG -jev, osnovni molekularni mehanizmi vsakega ISG ostajajo v glavnem neznani.Na splošno je sprejeto, da veliko beljakovin komunicira z enim ali več citokini, da se zagotovi polna aktivnost, zato bodisi ISG -ji neposredno vplivajo bodisi neposredno bodisi njihove interakcije posredujejo celični proteini.Na primer, nedavna študija PhotocrosLink Proteomics je opredelila ATPaze VCP/P97 kot glavnega partnerja za interakcijo IFITM3, katerega inhibicija vodi do napak pri lizosomalnem razvrščanju, prometu in sodportu IFITM3 z virusnimi delci 14.Z imunoprecipitacijo smo identificirali VAPA, protein, povezan z veziklom, kot interakcijski partner z IFITM1/2/3, ki posreduje z virusnim zorenjem, ki ga posreduje holesterol, in to je bila potrjena z drugo študijo z uporabo dvohibridnega sistema kvasovk.Znanstvena podpora 15, 16.
Temeljni biološki proces, ki sodeluje pri zatiranju okužbe in maligne transformacije, je predstavitev antigena, ki jo posreduje glavne molekule kompleksa histokompatibilnosti (MHC).Peptidi (dolge 8-12 aminokislin) iz cepljenih, prezgodaj zaključenih ali napačnih beljakovin se naložijo v heterodimer MHC-I (sestavljeni iz težkih in lahkih verig MHC-I, imenovane β-2-mikroglobulin; β2m) 17,18.Nastale stabilne trimere MHC-I se prevažajo na celično površino, kjer predstavljajo znotrajcelične peptide v celice CD8+ T (citotoksične T celice) 17.T celice prepoznajo in uničujejo te patogene in celice, ki nosijo tumorsko specifični antigen.Posledično patogene in tumorske celice pogosto zavirajo postopek predstavitve antigena, da se izognejo imunskemu nadzoru.Poleg tega je MHC-I znižan v 40-90% človeških tumorjev in je pogosto povezan s slabšo prognozo19.
Geni, ki sodelujejo pri odzivanju na patogene, morajo hitro preklopiti med stanjem počitka in stanjem aktivne transkripcije.Zato se domneva, da je več celičnih beljakovin v kratkem času vključeno v odziv na veliko povpraševanje IFN, vključno s preoblikovanjem in spreminjanjem promotorskega kromatina 20,21.Večina raziskav se je osredotočila na identifikacijo posameznih beljakovinskih partnerjev ISG v prisotnosti IFN.Več proteomskih in transkriptomskih študij v modelnih celičnih sistemih je razjasnilo učinek IFN na celično pokrajino.Kljub vse večjemu razumevanju dinamike, ki jo povzročajo interferoni, še vedno vemo malo o vključitvi ISGS.Pri upoštevanju zapletenosti in časovno odvisne dinamike interferonske signalizacije se pojavita dve vprašanji: (i) Ali je mogoče stabilizirati in ujeti multiproteinske komplekse, vključene v hitro signalizacijo, in (ii) lahko te interakcije preslikamo v 3D prostor?
Za reševanje teh vprašanj smo izvedli discikcinimid suberat-posredovano kemično navzkrižno povezovanje (DSS) skupaj z masno spektrometrijo (CLM) za preučevanje mreže interakcij beljakovin, ki ga povzroča IFNα, in njeno dinamiko.DSS dodaja kovalentne vezi med proksimalnimi ostanki beljakovin in/ali beljakovinskih kompleksov in vivo.Naslednja analiza MS razkriva specifična mesta zamreženja, ki odražajo prostorsko bližino regij znotraj določenega proteina, imenovane notranje povezave ali podenote v beljakovinskih kompleksih, imenovanih medsebojno povezanost.S tem pristopom smo identificirali več novih beljakovinskih beljakovinskih kompleksov, pa tudi interferonske multiproteinske interakcijske mreže.Z nadaljnjim testiranjem podskupine teh novih interakcij dokazujemo, da H2BF (H2B histonski tip FS; v nadaljevanju H2B) in MDN1 delujeta kot zavezujoči partnerji za HLA-A.
Celice Flo-1 so eden najbolj znanih in vitro modelov adenokarcinoma požiralnika, saj posnemajo ključne značilnosti ezofagealnih tumorjev22,23.Vendar pa niso vsi tumorji imunogeni in da bi ugotovili, ali se celice Flo-1 odzivajo na zdravljenje z interferonom, smo 72 ur zdravili celice Flo-1 z 10 ng/ml IFNα.Celice Flo-1 so pokazale zgodnjo indukcijo PStat1 in IRF1, ki se začnejo 2 uri po zdravljenju in nadaljujejo 72 ur, s časovno odvisnim znižanjem stacionarnih ravni IRF1 (slika 1A).Ugotovljeno je bilo, da so ISG (MX1, IFITM1, OAS1/2 in ISG15) močno inducirani po 6 urah, kar posnema klasične odzive srednje in pozno faze na IFNα (slika 1A).Ti podatki skupaj kažejo, da se ta celični model lahko uporabi za preučevanje odzivov interferona.
Diferencialni odzivi na beljakovine v celicah Flo-1 po zdravljenju z IFNα.(A) Ekspresija beljakovin v celicah Flo-1, zdravljenih z 10 ng/ml IFNα za 2, 6, 24, 48 in 72 ur, smo analizirali z imunoblotom z uporabo navedenih protiteles ISG.(B) Coomassie modri obarvani geli SDS-PAGE celotnih celičnih ekstraktov po navzkrižnem povezovanju z DSS za navedene čase in koncentracije.(C) Reprezentativni imunoblot, pregledan s protitelesom p53 (DO-1) iz istih vzorcev, da bi ocenil stopnjo beljakovinskega navzkrižne povezave.
Za zajem in situ beljakovinske pokrajine smo uporabili DSS, široko uporabljeno navzkrižno sredstvo zaradi njegove visoke membranske prepustnosti in relativno kratkega reakcijskega časa.Krajši reakcijski čas pomaga preprečiti tvorbo velikih agregatov zamreženih beljakovin in s tem ohranjanje stabilnosti križanca.Za določitev optimalne koncentracije DS in se izognili prekomernemu povezovanju, smo celice najprej izpostavili na 5, 2,5 in 1 mM DS za 5, 10, 5 in 30 minut ter analizirali lizate s Coomassie, obarvanimi s SDS-PAGE (podatki niso prikazani).Zdi se, da so celični lizati zelo navzkrižno povezani z najnižjo koncentracijo in v najkrajši časovni točki.Zato smo DSS titrirali na 1, 0,5 in 0,1 mm v 5 minutah (slika 1B).Optimalno zamreževanje smo opazili z 0,5 mM DSS 5 minut, ti pogoji pa so bili izbrani za celice, zdravljene z IFNα.Poleg tega na sliki 1C prikazuje Western blot, izveden s protitelesom P53 (DO-1) za oceno stopnje navzkrižne povezave beljakovin.
Celice Flo-1 smo 24 ur obdelali z 10 ng/ml IFNα, preden smo dodali zamreženo.Navzkrižno povezane celice smo nato lizirali z dvostopenjsko proteolizo, beljakovine pa smo predelali s FASP (slika 2) 24,25.Navzkrižno vezani triptični peptidi smo analizirali z masno spektrometrijo (slika 2).Spektri MS/MS se nato ujemajo z zaporedjem beljakovin in količinsko opredeljeni z Maxquant26,27.Med povezanimi peptidi so bili identificirani iz pridobljenih spektrov s programom SIM-XL, posamezne spojine pa so bile združene v kompleksno omrežje z uporabo programske opreme za računalniško računalništvo XQUEST28 in SIM-XL29 (slika 2).SIM-XL identificira interakcije beljakovin in beljakovin, notranjih verig in posameznih verig v preprostih ali zapletenih beljakovinskih mešanicah ter zagotavlja skripte za vizualizacijo interakcij v beljakovinskih strukturah.Poleg tega vsako navzkrižno referenco uvršča med oceno ID v skladu s kakovostjo spektra MS/MS29.Ugotovljenih je bilo več zelo zanesljivih interakcij in kompleksov beljakovin in beljakovin, nov niz interakcij pa je bil nadalje raziskan z uporabo so-imunoprecipitacije in konformacijskih sprememb kompleksov z uporabo modeliranja molekularne dinamike (MD) (slika 2) 30, 31.
Shematski pregled metode CLMS.Celice Flo-1 smo 24 ur obdelali z 10 ng/ml IFNα, ki mu je sledilo in situ beljakovinsko vezanje z uporabo DSS, ki mu je sledila liza celic in tripsinizacija.Skrajne vzorce smo analizirali z uporabo masnega spektrometra Orbitrap in nadalje vzorčili za fragmentacijo prekurzorjev peptidov med LC-MS/MS.Iz dobljenih spektrov sta bila identificirana dva povezana peptida z uporabo stroja za prepoznavanje spektra v programu za prekrižane peptide (SIM-XL), vse spojine pa so bile združene v kompleksno omrežje z uporabo računalniških cevovodov.Filtrirajte interakcije z nizko zaupanje na podlagi rezultatov lažne pozitivne hitrosti (FDR).Več novih interakcij beljakovin in beljakovin z visoko zvestobo je bilo nadalje potrjenih z uporabo ko-imunoprecipitacije, konformacijske spremembe v kompleksih pa so bile pregledane z modeliranjem molekularne dinamike (MD).
Skupno je bilo zaznanih približno 30.500 in ~ 28.500 peptidov z uporabo maxquant v nestimuliranih in stimuliranih vzorcih IFNα (dodatna tabela S1, slika 3A).Porazdelitev dolžine peptida v obeh primerih je pokazala večji delež večjih peptidov, kar kaže na prisotnost navzkrižno povezanih peptidov (slika 3B, C).Poleg tega je bil v vzorcu, zdravljenih z IFNα (slika 3C), prisoten večji delež večjih peptidov v območju 40–55.Preslikava beljakovin proti intenzivnosti LOG2 je pokazala, da so bili klasični interferoni stimulirani proteini najpogostejši v primerjavi z neobdelanimi vzorci, vključno z MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 in HLA-F (slika 3D).Analiza poti za beljakovine, več kot trikrat obogatene kot odgovor na zdravljenje IFNα z uporabo baze podatkov Reactome Pathway, je pokazala, da je bila najbolj prevladujoča pot in obdelava antigena, ki jo posreduje MHC-I, najbolj prevladujoča pot (slika 3E).V skladu s prejšnjimi poročili so bili protivirusni odzivi, ki jih posredujejo OAS in ISG15 ter signalizacija IFNα/β in citokina, med aktiviranimi potmi.Poleg tega so bile iz prvotno pridobljenih MS/MS s pomočjo SIM-XL identificirane lizin-in serinsko specifične beljakovinske navzkrižne povezave.Nedavna študija je poročala o 104 ISG-jih, ki obsegajo 20 virusov iz 9 virusnih razredov z metaanalizo posameznih prekomernih študij ISG v 5 tistih celic9.Za premagovanje računskih omejitev presejanja velikih naborov podatkov smo začeli z manjšim naborom podatkov za raziskovanje možnih interakcij med seznamom genov IRDS, o katerih poročajo Padaria in sod.
Identifikacija različno izraženih navzkrižno povezanih beljakovin kot odgovor na IFNα (podatki, dobljeni iz Maxquant).(A) Vennov diagram, ki predstavlja število skupnih in ekskluzivnih peptidov, identificiranih v vzorcih, zdravljenih in neobdelanih IFNα14.Porazdelitev dolžine peptida neobdelanih (B) in IFNα obdelanih (C) zamreženih vzorcev.(D) toplotna karta, ki predstavlja LOG2 (intenzivnost LFQ) med neobdelanimi in IFNα14, obdelanimi s celicami Flo-1.Na levi plošči so prikazani beljakovine, ki so najbolj aktivirani v prisotnosti IFNα.(E) Histogram, ki predstavlja 20 glavnih obogatitvenih poti po zdravljenju z IFNα.Baza podatkov React Pathway je analizirala več kot štirikratne spremembe v ureguliranih IFNα-odzivnih beljakovinah.
Stimulacija ISG, posredovana z interferonom, je dobro dokumentirana, na molekularni ravni pa je slabo razumljeno, kako se ti beljakovine končajo v širokem razponu bioloških funkcij.Raziskali smo interakcije beljakovin z visoko stopnjo zaupanja med znanimi ISG.Zanimivo je, da smo identificirali omrežje, vključno z proteini MX1, USP18, Robo1, OAS3 in STAT1, ki tvorijo velik kompleks kot odgovor na zdravljenje IFNα (slika 4, tabela S2) 32,33,34.Najpomembneje je bilo, da so bile te interakcije v vseh triplenih, zdravljenih z IFNα, in jih niso našli v neobdelanih vzorcih, kar kaže na to, da so bile oblikovane posebej kot odgovor na zdravljenje IFNα.Znano je, da Transkripcijski STAT1 uravnava izražanje teh ISG -jev, vendar njegovo interakcijo z ISGS na ravni beljakovin ni bilo preučeno.Kristalna struktura STAT1 je pokazala, da njegova spiralna domena (CCD) med tvorbo dimerjev35 ni vključena v interakcijo z DNK ali protomerji.Te α-vijačnice tvorijo spiralno strukturo vijačnic, ki zagotavlja pretežno hidrofilno površino, da se medsebojne interakcije pojavijo 35.V naših podatkih CLM smo opazili, da se je večina interakcij s STAT1 pojavila v domeni SH2 pred CCD, domeno veznika ali repu C-terminala (ostanki 700-708) (slika 4A).Prejšnja študija je poročala, da se USP18 veže na domeno CCD in DNA, ki veže DNK (DBD) STAT2 in se rekrutira v podenoto interferonskega receptorja IFNAR2 tipa I, da posreduje inhibicijo signalizacije interferona tipa I.Naši podatki so tudi pokazali, da katalitična domena USP18 medsebojno vpliva na DBD STAT1 (slika 4A, D), kar kaže na to, da lahko tako Stat1 kot STAT2 igrata vlogo pri privabljanju USP18 k IFNAR2.
Omrežje ISG beljakovin-protein, identificirano v navzkrižnih celicah, zdravljenih z IFNα.(A) 2D interakcijski zaplet, ki prikazuje interakcije beljakovin in beljakovin (ustvarjene v programu SIM-XL), pri čemer črte predstavljajo medmolekularne interakcije (CrossLink Clouff, nastavljeno na 3.5).Domene različnih identitet so označene z njihovo barvo32: MX1 domena, Dynamin_n (73–249), Dynamin_m (259–547) in GED (569–660).OAS3 Domene: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_TRANSF_2 (780-872) in OAS1_C (903-108).Domain Robo1, IG_3 (67–151), I-SET (170–258), I-SET (262–347), IG_3 (350–432), IG_3 (454–529), FN3 (562–646), FN3, FN3 (678–758) in FN3 (777–864).Polja STAT1: STAT_INT (2–120), STAT_ALPHA (143–309), STAT_BIND (321–458), SH2 (573–657) in STAT1_TAZ2BIND (715–739).(B) Krožni pregledovalnik navzkrižnih beljakovin (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 in STAT1) z interakcijami in interakcijami, označenimi z modro in rdečo barvo.Prag navzkrižne povezave je bil nastavljen na 3,5.Pikalne ploskve označujejo mesta interakcije STAT1 z MX1 (C), USP18 (D), Robo1 (E) in OAS3 (F), pa tudi med mesti interakcije K ali S med obema peptidoma.Na sliki je prag ocene navzkrižne povezave nastavljen na 3,0.(G) različna interakcijska mesta med domenami STAT1 in OAS3 DI, nameščena na njihovih beljakovinskih strukturah v Pymolu (Pymol Molekularni grafični sistem, različica 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (PDB ID: 1BF533) in OAS3 (PDB ID: 4S3N34).) program.
Dve izoformi USP18 sta bili opisani pri ljudeh, beljakovina v celotni dolžini, ki se pretežno nahaja v jedru, in izoforma brez N-terminalne domene, USP18-SF, ki je enakomerno porazdeljena v citoplazmi in jedru 36.Poleg tega je bilo predvideno, da je N-konec nestrukturiran in ne potrebuje aktivnosti izopeptidaze ali vezave ISG1537.Večina interakcij, opredeljenih v naši raziskavi, je bila nameščena na N-koncu proteina, kar kaže na to, da te interakcije vključujejo celotno dolžino USP18 (slika 4A, D) in se tako verjetno pojavljajo v jedru.Poleg tega naši podatki kažejo tudi, da je N-konec specializiran za interakcije med beljakovinami in beljakovinami.Mesto vezave IFNAR2 se nahaja med ostanki 312-368, predvsem pa se noben od proteinov v kompleksu ne veže na to območje (slika 4A) 37,38.Ti podatki skupaj kažejo, da domena vezave IFNAR2 uporablja izključno receptorski protein.Poleg tega je bilo ugotovljeno, da sta samo OAS3 in ROBO1 povezana z domenami navzgor od mesta N-terminusa in IFNAR2 (slika 4A).
Robo1 spada v imunoglobulinsko (IG) superdružino transmembranskih signalnih molekul in je sestavljen iz petih domen IG in treh domen fibronektina (FN) v zunajceličnem območju.Tej zunajcelične domene sledi membransko-proksimalno območje in eno samo transmembransko vijačnico 39. Nestrukturirano znotrajcelično območje se nahaja na C-koncu in vsebuje ohranjene motive zaporedja, ki posredujejo vezavo efektorjevega proteina39.Območje, ki sega od aminokislin ~ 1100 do 1600, je večinoma neurejeno.Ugotovili smo, da MX1 deluje z robo1 prek IG, FN in znotrajceličnih domen, medtem ko se večina interakcij s STAT1 pojavlja med njenim CCD, veznikom domeno in C-koncem Robo1 (slika 4A, E).Po drugi strani so bile interakcije z regijami DI, DIII in OAS3 razdeljene po celotnem beljakovinah robo1 (slika 4A).
Družina beljakovin oligoadenilata (OAS) sprejema in veže znotrajcelične dvoverižne RNA (dsRNA), doživi konformacijske spremembe in sintetizira 2 ', 5'-vezane oligoadenilate (2-5 AS) 40.Ugotovljeno je bilo, da med tremi OAS3 ima OAS3 najvišjo afiniteto za dsRNA in sintetizira najmanj 2-5 AS, ki lahko aktivira RNazo L in s tem omeji virusno replikacijo 41.Družina OAS je sestavljena iz polimeraznih beta (Pol-β), podobnih nukleotidnim transferaznim domenom.Prejšnje raziskave so pokazale, da je katalitična aktivnost C-terminalne domene (DIII) odvisna od domene, ki veže dsRNA (DI), kar je potrebno za aktiviranje OAS342.Opazili smo, da domene DI in DII OAS3 medsebojno vplivajo na CCD in majhno stičišče med SH2 in STAT1 TAD (slika 4A, F).Prekrivanje različnih mest za prekrižanje na beljakovinski strukturi je pokazalo interakcijo med β-listom in DBD STAT1 zanko in odprtim žepom ali votlino, ki jo tvorijo ostanki 60–75 v domeni DI OAS3 (slika 4G).Orientacija beljakovin v kompleksu je tudi pokazala, da nobena interakcija z OAS3 ni posegla v sposobnost vezave DNK njegove DI domene (slika S1A).Poleg tega N-terminalna domena GTPase MX1 obsežno deluje z domeno DI in DIII OAS3 (slika 4A).Opazili smo tudi interakcijo med OAS1 in MX1 v vseh treh ponovitvah, ki so bile obdelane z IFNα, kjer je ena domena OAS1 (tudi katalitično aktivna) medsebojno sodelovala z vsemi tremi domenami MX1 (slika S2A, B).
MX beljakovine so del velike družine dinineina podobnih GTPaz, ki vsebujejo N-terminalno domeno GTPaze, ki veže in hidrolizira GTP, vmesno domeno, ki posreduje samonastavljeno, in C-terminalno zadrgo levcine, ki deluje kot GTPase (LZ (LZ (LZ ).Domena domene domene25,43.MX1 se veže na podenote virusnih polimeraz, da blokira transkripcijo virusnega gena43.Predhodno poročani dvojski zaslon kvasovk je pokazal, da MX1, povezan s PIAS1, zavira aktivacijo gena, ki jo posreduje STAT1, z blokiranjem aktivnosti vezave DNA in ima tudi aktivnost ligaze SUMO E344,45.Tukaj dokazujemo, da se MX1 veže na STAT1 (slika 4C, D), vendar kako ta interakcija vpliva na aktivacijo gena, posredovane s STAT1, kot odgovor na IFNα, je treba nadaljnjo študijo.Poleg tega smo ugotovili tudi, da je MX1 v vseh treh ponovitvah, ki jih obdelujejo IFNα, v interakciji z IFIT3 in DDX60 (slika S2C).
DDX60 je citoplazemska helikaza, ki jo povzroča IFN, za katero so že prej poročali, da igra vlogo pri razgradnji virusne RNA46.Sodeluje s RIG-I in aktivira svojo signalizacijo na ligand specifičen način 46. DDX60 je sestavljen iz domene dexd/H-box helikaze in C-terminalne domene helikaze, ki veže virusno RNA in DNA47.Večina njegovih interakcij z MX1 in IFIT3 se pojavlja v dolgih N- in C-terminalnih regijah brez kanonskih domen ali motivov (sl. S2E, F).Vendar je MX1 povezan tudi z domeno dexd/H-box helikaze (slika S2E).Beljakovine družine IFIT imajo tandemske kopije značilnega motiva vijak-turne-vijak, imenovanega ponovitev tetrapeptida (TPR).Ugotovljeno je bilo, da je IFIT3 pozitiven modulator signalizacije Rig-I in s tem tudi sestavni del kompleksa MAVS.Naši podatki skupaj kažejo, da IFIT3 in DDX60 delujeta predvsem v regiji med TPR 3–6 IFIT3 in imata lahko vlogo pri signalizaciji Rig-I/Mavs (slika S2F).
Glede na to, da je pregledovanje celotnega proteoma računsko intenzivno, smo nato pregledali celotno človeško bazo podatkov Uniprot za prisotnost ene od ponovitev, ki se zdravi z IFNα.V tej repliki smo našli več zelo zanesljivih interakcijskih omrežij za HLA-A.Analiza beljakovinskih poti, opredeljenih s spektri MS/MS, je pokazala, da je obdelava in predstavitev antigena na osnovi MHC-I glavna pot, ki jo povzroči interferon (slika 3D).Zato smo se osredotočili na preučevanje beljakovinskih interakcij molekul MHC-I z visoko stopnjo zaupanja v vse navzkrižno povezane vzorce.HLA je sestavljena iz domen α1, α2 in α3 in lahkih verig, mikroglobulin β2 (β2M) pa je konstanten kaperonski protein49.Ko je sestavljena v endoplazemskem retikulumu, je HLA nestabilna v odsotnosti peptidnih ligandov50.Utor, ki veže peptide, tvori visoko polimorfno in nestrukturirano domeno α1 in α2 v nepeptidni obliki ter relativno manj polimorfne domene α351.V prisotnosti IFNα smo zaznali dva kompleksa HLA-A: eden je v interakciji s HMGA1 in H2B (slika 5, tabela S3), drugi pa sodeluje z MDN1, LRCH4 in H2B (slika 6).
IFNα inducira interakcijsko mrežo HLA-A s H2B (H2BFS) in HMGA1.(A) 2D ploskva (ustvarjena v programski opremi SIM-XL), ki prikazuje različne vrste interakcij v kompleksu H2B-HLA-A-HMGA1: InterLink (modra), Interlink (rdeča) in enojna povezava (črna)..Domene različnih identitet so barvno kodirane32: H2B (histon; 2–102) in MHC-I (MHC_1; 25–203, skupina C1; 210–290 in MHC_I_C; 337–364).Prag navzkrižne povezave je bil nastavljen na 3,5.Pikalne ploskve označujejo mesta interakcije HLA-A s H2B (B) in HMGA1 (C), kot tudi na mestih interakcij K ali S med obema peptidoma.Na sliki je prag ocene navzkrižne povezave nastavljen na 3,0.(D) Razmerje med beljakovinami, prikazanimi v strukturah beljakovin H2B, HLA-A in HMGA1, v programu Pymol.Te strukture so bile modelirane z uporabo strežnika Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2), strukture predlogov za beljakovine H2B, HLA-A in HMGA1 pa 1kx552, 1KJ349 in 2eze55.
IFNα inducira interakcijsko mrežo HLA-A s H2B (H2BFS), MDN1 in LRCH4.(A) Intramolekularne (rdeče) in medmolekularne (modre) križne vezi, predstavljene na 2D interaktivnem zemljevidu (ustvarjene v programski opremi SIM-XL) z MDN1, predstavljenim kot krog.Prag navzkrižne povezave je bil nastavljen na 3,5.Domene različnih identitet so barvno kodirane32: H2B (histon; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, skupina C1; 210–290 in MHC_I_C; 337–364) in LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) in CH (535–641)).(B) Razmerje med beljakovinami, prikazanimi v strukturah proteinov H2B, HLA-A, LRCH4 in MDN1, v programu Pymol.Te strukture so bile modelirane s pomočjo strežnika Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) z strukturami predloge 1kx552, 1KJ349, 6Hlu62 in 6i2665 za H2B, Hla-A, Lrch4 in MDN1 in MDN1 in MDN1 in MDN1 oziroma.Pikalne ploskve, ki prikazujejo K ali S interakcijska mesta za HLA-A s H2B (C), LRCH4 (D) in MDN1 (E).Za parcele je bil prag ocene navzkrižne povezave nastavljen na 3,0.
Poleg ohranjanja celovitosti genoma je v regulacijo transkripcije vključen tudi histon H2B.Protein H2B je sestavljen iz osrednje domene histona (HFD), ki jo tvorijo tri α-vijake, ločene z zankami in C-terminalnim repom 41,52.Večina interakcije s H2B se pojavi v vijačnici α1, ki zagotavlja trimerizacijo s heterodimerom HFD (slika 5A, B).Čeprav so lizini vključeni v vezavo DNA, so nekateri lizini tudi alternativna mesta acetilacije ali metilacije.Na primer, ostanki K43, K46 in K57 iz H2B niso vključeni v neposredno vezavo DNK, ampak so tarče različnih sprememb po transkripciji53.Podobno lahko ostanki K44, K47 in K57 v H2B igrajo alternativno vlogo v prisotnosti IFNα, vključno z interakcijami z drugimi proteini (slika 5A, B).Poleg tega ekstrakromosomski histon H2B aktivira imunski odziv pri različnih vrstah celic, ki deluje kot citosolni senzor za odkrivanje dvostranskih fragmentov DNA (dsDNA), ki izhajajo iz nalezljivih sredstev ali poškodovanih celic54.V prisotnosti virusov DNK je izčrpavanje H2B zaviralo proizvodnjo IFN-β in fosforilacijo STAT154.Znano je, da se H2B premika tudi v jedro in iz njega hitreje kot drugi jedrski histoni54.V izbranih neobdelanih vzorcih so opazili tudi interakcije H2B z MDN1 in LRCH4.Ugotovili smo, da je HLA-A v vseh treh vzorcih, zdravljenih z IFNα, v interakciji s H2B in v enem neobdelanem ponovnem vzorcu.Ti podatki odražajo vlogo H2B v alternativni fiziološki funkciji, neodvisno od regulacije transkripcije.
V povezavi s HLA-A je bila ugotovljena HMGA1 (skupina z visoko mobilnostjo At-Hook 1), majhna nukleoprotein, bogata z aminoislinami, ki spodbujajo bolezen.Ima kisli C-terminalni rep in tri različne DBD, imenovane pri kavljih, ker se vežejo na manjši utor regije, ki je bogata z AT, v DSDNA55,56.Ta vezava povzroči, da se DNK upogne ali poravna, kar omogoča, da kanonični transkripcijski faktorji dostopajo do njegovega soglasnega zaporedja.Verjame se, da je C-terminalni rep vključen v interakcije beljakovin in beljakovin in rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev, saj mutanti za delecijo C-terminala ne morejo sprožiti transkripcije57.Poleg tega ta domena vsebuje več ohranjenih mest fosforilacije, ki so znani substrati za kinaze 58.Opazili smo interakcije HLA-A in H2B s HMGA1 zunaj C-terminalne domene, kar kaže na to, da se C-terminalna domena uporablja predvsem za vezavo transkripcijskega faktorja (slika 5A, C).HMGA proteini tekmujejo s histonom H1 za vezavo na adapter DNK in s tem povečajo dostopnost57.Podobno se zdi verjetno, da HMGA v konkurenci s histonom H1 sodeluje s histonom H2B vzdolž povezave DNK.HMGB1 inducira ekspresijo HLA -A, -B in -C v dendritičnih celicah, kar vodi do njihove aktivacije59, vendar interakcije med HMG in HLA še niso poročale.Ugotovili smo, da HMGA1 sodeluje z domenom α1 in α3 HLA-A, večina interakcij zunaj njegovih 3 dBD (slika 5A, C).V naših rokah je bilo ugotovljeno, da je HLA-A lokaliziran v jedru (podatki niso prikazani) in glede na to, da sta H2B in HMGA1 prisotna tudi v jedru, se ta interakcija verjetno pojavi v jedru.Specifični adukti, izmerjeni med H2B, HLA-A in HMGA1, so prikazani na sliki 5D.
Večina interakcij HLA-A z drugimi beljakovinami se pojavlja v njegovih domenah α1 in α2 in neurejene C-terminalne domene (slika 6).V enem od teh primerov smo ugotovili, da HLA-A deluje z neurejenim N-terminalnim repom LRCH4 (slika 6A, D).LRCH4 uravnava aktivacijo TLR4 in indukcijo citokinov LPS, s čimer modulira prirojen imunski odziv60,61.Gre za membranski protein z devetimi ponovitvami, bogatimi z levcinom (LRRS) in motivom homologije kalmodulina (CH) v svojem ektodomainu, ki mu sledi transmembranska domena (TMD) 60, 62.Poročali so, da domene CH posredujejo med interakcijami beljakovin in beljakovin 60.Raztezanje približno 300 aminokislin med domenom LRR in CH je razmeroma dostopno, vendar neurejeno.Na podlagi funkcije neurejenih regij kot mediatorjev beljakovinskih beljakovinskih omrežij in vezikularnega transporta 63 smo ugotovili, da se večina interakcij beljakovin pojavlja v neurejenih regijah.Interakcije z MDN1 so bile razporejene po celotni dolžini beljakovin, vključno z domenami LRR1, LRR6, CH in naključnimi regijami, medtem ko je H2B vezan na domeno CH (slika 6A, B).Zlasti nobena od interakcij ni vključila TMJ, kar kaže na specifičnost pristopa CLMS (slika 6A, b).
MDN1 je bil opredeljen tudi kot del proteinske mreže HLA-A (slika 6A).Pripada družini beljakovin AAA (ATPaze, povezane z različnimi dejavnostmi).To je enaka N-terminalna AAA domena, ki organizira v heksamerni obroč in odstrani faktor montaže iz 64-ih 64 ribosomske podenote.Zdi se, da je podobna Dyneinu64,65,66.Poleg tega regiji ASP/Glu, bogato, sledi domena Midas (mesto, odvisno od kovinskih ionov).Zaradi velike velikosti MDN1 (približno 5600 aminokislin) in njene omejene homologije z dobro preučenimi beljakovinami je malo znanega o njegovi strukturi in delovanju pri ljudeh.HLA-A, H2B in LRCH4 smo identificirali kot vezavne partnerje MDN1 in razkrili njihovo orientacijo kot proteinske komplekse v Pymolu (slika 6A, B).Ti trije proteini delujejo z domeno AAA, domeno, podobno Dyneinu, in morda domeno MIDAS MDN1.V prejšnjem poročilu je čiščenje afinitete beljakovin vabe identificiralo MDN1 kot protein, povezan s histonom H2B67.Poleg tega je nedavna študija poročala tudi o interakciji med MDN in HLA-B v celicah HCT116 z uporabo masne spektrometrije, ki je prežeta s afiniteto, kar je podpiralo naše ugotovitve68.Identifikacija tega kompleksa v vzorcih, zdravljenih z IFNα, kaže na vlogo MDN1 pri signalizaciji interferona.
Ker so geni HLA zelo polimorfni, smo izvrnili sekvenciranje odčitavanja preslikave HLA -A, -B in -C iz podatkov o sekvenciranju RNA iz celic Flo -1 (podatki niso prikazani).Peptidne sekvence, skladne z branjem sekvenciranja, so pokazale pomembne razlike med HLA-A, -B in -C v regijah, kjer so bili navzkrižni peptidi nameščeni v HLA-A (slika S3).Poleg tega nismo opazili navzkrižnega vezanja beljakovin-beljakovin molekul HLA-B/C s proteini H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.To kaže, da je interakcija beljakovin med HLA-A, MDN1, LRCH1 in HMGA1 specifična.Poleg tega je proteomska analiza neobrezanih vzorcev (tabela S4) pokazala, da ima HLA-A večjo pokritost zaporedja v primerjavi s HLA-B ali HLA-C.Peptidi, identificirani za HLA-A, so bili intenzivnosti tako v vzorcih, zdravljenih z IFNα, in neobdelanih vzorcev.
Da bi zagotovili, da tukaj ugotovljene interakcije niso posledica nespecifičnega navzkrižnega vezanja dveh beljakovin v tesni prostorski bližini, smo nadalje potrdili dva nova dejavnika, ki se medsebojno HLA-A, z izvajanjem so-imunoprecipitacijskih testov.Interakcije HLA-A z endogenimi MDN1 in H2B so bile odkrite tako v celicah, zdravljenih z IFNα in neobdelanimi celicami Flo-1 (slika 7, slika S4).Potrdili smo, da je HLA-A zajel H2B v imunoprecipitatih in da je bila ta povezava posledica zdravljenja IFNα, saj je HLA-A v vzorcih imunoprecipitata odsoten iz neobdelanih celic (slika 7A).Vendar pa naši podatki kažejo, da IFNα različno uravnava vezavo HLA-A na H2B in MDN1.IFNα inducira povezavo med H2B in HLA-A, vendar zmanjša svojo povezanost z MDN1.Ugotovili smo, da je MDN1 povezan s HLA-A v kontrolah, dodajanje IFNα pa je to interakcijo zmanjšalo neodvisno od indukcije MDN1 z IFNα (slika 7B, C).Poleg tega je imunoprecipitacija HLA-A zajela H2B v celicah A549 (slika S4), kar kaže na to, da je ta interakcija neodvisna od vrste celice.Ti rezultati skupaj podpirajo interferonske interakcije HLA-A s H2B in MDN1.
HLA-A-A-zavzema H2B in MDN1.Reprezentativni endogeni imunoloti H2B (A) in MDN1 (B) smo imunoprecipitirali iz celic Flo-1, zdravljenih z IFNα, in sondirali za navedena protitelesa.Mišji in zajčji IgG sta bila uporabljena kot negativna kontrola.(C) Relativne količine (vhod) različnih antigenov so upodobljene z imunobloti, preizkušenimi na navedenih protiteles, kot kontrolo nalaganja je bil uporabljen β-aktin.
Raziskali so strukturne lastnosti ene od interferonskih zelo zanesljivih navzkrižnih omrežij, H2B-HLA-A-HMGA1.Za razumevanje konformacijske dinamike beljakovin, vključenih v ta kompleks, smo uporabili modeliranje molekularne dinamike kot alternativni pristop (slika 8).Sklepi iz podatkov CLMS kažejo na možnost različnih skladb proteinov H2B, HLA-A in HMGA1.Zato so bili naslednji potencialni kompleksi modelirani v mediju topila: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A in H2B-HLA-A-HMGA1.Začetni zaslon za priklop beljakovin-beljakovin z uporabo MOE (Molecular Operating Environment; Paket Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) je predlagal možne skladnosti, ki se med temi proteini razlikujejo (slika 8A).Vizualizacija priključnega beljakovinskega kompleksa je pokazala več interakcij in možnih skladb (slika 5A, 8).Tako je ena možna konformacija prikazana na sliki 8A (z označenimi navzkrižnimi vezmi) in je bila nadalje ovrednotena z uporabo cevovoda za modeliranje MD.Poleg tega vezava H2B ali HMGA1 na HLA-A poudarja višjo afiniteto H2B za HLA-A (slika 8A).
Konformacijska dinamika možnih omrežij med kompleksi H2B (H2BFS) -HLA-A, HMGA1-HLA-A in H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Leva plošča je 2D zemljevid (ustvarjen v programski opremi SIM-XL) intramolekularnih (rdečih) in medmolekulskih (modrih) križnih vezi (CrossLink Clouff, nastavljeno na 3.5).Poleg tega so identificirani navzkrižni ostanki označeni na strukturah proteinov H2B, HLA-A in HMGA1.Pridružene konformacije teh beljakovin so bile ekstrahirane s pomočjo priključnega cevovoda, ki je bil izveden v paketu MOE.Spodnja leva plošča prikazuje različne možne skladnosti kompleksov H2B-HLA-A in HMGA1-HLA-A z različnimi afinitetami vezave beljakovin-beljakovin (GBVI/WSA DG; KCAL/MOL).(B) Standardni odklon (RMSD) atomskih položajev (razen vodikovih atomov) za vsako beljakovinsko strukturo.(C) Intermolekularna interakcija z beljakovinami in proteinom vodikove vezi iz različnih simuliranih kompleksov glede na specifične interakcije trajanja ≥ 10 ns.Razdalja mejnega donosa H-vezi je bila nastavljena na 3,5 Å, kot izklopnik darovalca-H-sprejemnika pa je bil nastavljen na ≥ 160 ° -180 °.(D) Označeni ostanki, ki tvorijo interakcije beljakovin-beljakovin HLA-A s svojimi partnerji, ki segajo ≥ 20 ns, izvlečene iz lutk HLA-A-H2B in HLA-A-HMGA1 kompleksov.Proteinske strukture predstavljajo povprečno strukturo 100 ns MD -jev.(E) Interakcije med kompleksi HLA-A-H2B in HLA-A-HMGA1 v primerjavi z interakcijami, ki jih spremlja simulacija H2B-HLA nad 100 ns na podlagi mesta interakcije K ali S med obema peptidoma.Kompleksi /HMGA1-HLA-A /H2B-HLA-A-HMGA1.Mejna vrednost za oceno navzkrižnih povezav je bila nastavljena na 3,0, upoštevane pa so bile specifične interakcije MDS ≥ 10 ns.Beljakovinske strukture smo vizualizirali z uporabo Biovia Discovery Studio (Dassault Systèmes, Biovia Corp., San Diego, Kalifornija, ZDA) in molekularno delovno okolje (MoE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) paketov.
Stabilnost molekul HLA-A sčasoma (standardni odklon; RMSD ali standardni odklon; RMSF) je pokazala, da prisotnost proteinov H2B ali HMGA1 v kompleksih stabilizira HLA-A (slika 8B, slika S5).Protein HMGA1 se tesno veže na B2M mesto HLA-A, kar povzroči stabilnost aminokislin HLA-A v kompleksu HLA-A-HMGA1 ali H2B-HLA-A-HMGA1 (slika 8B, slika S5).Zlasti so ugotovili, da so ostanki HLA ~ 60-90 in ~ 180-210 v prisotnosti H2B manj prilagodljivi (slika 8B).H2B in HMGA1 sta pokazala boljšo vezavo na HLA-A v kompleksu H2B-HLA-A-HMGA1 v primerjavi z vezavo HLA-A na samo H2B ali HMGA1 (slika 8C, D; tabela S5).Ostanki, ki sodelujejo v vodikovem vezanju (MD, modelirani z visoko zasedenostjo ≥ 10 ns), sovpadajo z interakcijskimi mesti CLMS (K ali S ostanki) v kompleksu, kar kaže na to, da so interakcije, ki jih identificirajo CLM, zelo zanesljive.Zanesljivost (slika 8e).Pri modeliranju CLMS in MD je bilo ugotovljeno, da ostanki HLA-A med približno 190-210 in približno 200-220 aminokislin vežejo H2B oziroma HMGA1 (slika 8E).
Interakcije beljakovin in beljakovin tvorijo dinamične strukturne mreže, ki posredujejo medcelično komunikacijo kot odgovor na določene dražljaje.Ker mnogi pristopi proteomike odkrijejo spremembe v celotni ravni v stanju dinamičnega ravnovesja, dinamika interakcije med beljakovinami in beljakovinami zahteva dodatna orodja za zajem vezavnih vmesnikov, CLM pa je eno takšno orodje.Signalni sistem interferona je citokinska mreža, ki omogoča celicam, da se odzovejo na vrsto okoljskih patogenih in intrinzičnih patoloških signalov, vrhunec pri indukciji podskupin interferonskih inducibilnih beljakovin.Uporabili smo CLM, da smo ugotovili, ali je mogoče med skupino beljakovin, ki jih povzroča interferon, prepoznati nove interakcije beljakovin in beljakovin.Za zajem beljakovinskih kompleksov je bila uporabljena globalna analiza beljakovin v celičnem modelu Flo-1 v interferonu.Ekstrakcija triptičnih peptidov iz ne-križnih in navzkrižnih celic omogoča štetje peptidov, obogatitev poti in porazdelitev dolžine peptidov z določeno intenzivnostjo LFQ.Kanonični interferonski inducibilni proteini so bili identificirani kot pozitiven notranji nadzor, medtem ko so opazili nove medmolekularne in intramolekularne navzkrižno povezane adukte kanoničnih interferonskih beljakovin, kot so MX1, UP18, OAS3 in STAT1.Raziskali so različne strukturne značilnosti in interakcije na funkcionalnih območjih.
Interakcija med HLA-A, MDN1 in H2B smo odkrili z imunoblotiranjem v celicah Flo-1 in A549, zdravljenih in neobdelanih z IFNα.Naši rezultati poudarjajo, da so kompleksi HLA-A s H2B na način, ki je odvisen od IFNα.Naše delo predstavlja zanimivo pot za nadaljnje raziskovanje so-lokalizacije teh dveh kompleksov.Zanimivo bi bilo tudi razširiti pristop CLMS na ploščo celičnih linij, da bi identificirali interakcije beljakovin, ki jih ne posreduje celični tipi, neodvisno od celic.Nazadnje smo uporabili modeliranje MD kot alternativni pristop za razumevanje konformacijske dinamike beljakovin, ki sodelujejo v kompleksu H2BFS-HLA-A-HMGA1, ki je sledil intramolekularnim in medmolekularnim navzkrižnim pogovorom.Sklepi iz podatkov CLMS kažejo na možnost različnih skladb proteinov H2BFS, HLA-A in HMGA1.Možne različne konformacije med temi priključnimi proteinskimi kompleksi so pokazale več interakcij, podobnih tistim, ki so jih opazili v naboru podatkov CLMS.Ena glavnih prednosti naše metode je, da omogoča enostavno identifikacijo interakcij visoko polimorfnih genov, kot je HLA, zato bo zanimivo preučiti interakcije proteinov, specifičnih za HLA haplotip, ki jih je sicer težko preučiti.Skupaj naši podatki kažejo, da se lahko CLM uporabi za širitev našega razumevanja signalnih omrežij, ki jih povzročajo interferon, in zagotavljajo osnovo za preučevanje bolj zapletenih medceličnih sistemov v mikrookoliju tumorja.
Celice Flo-1 so bile pridobljene iz ATCC in vzdrževane v DMEM (GIBCO), dopolnjenem z 1% penicilinom/streptomicinom (Invitrogen), 10% fetalnega govejega seruma (GIBCO) in shranjeno pri 37 ° C in 5% CO2.Inkubacija.Celice so gojile na 70-80% sotočja, preden so jih zdravili z IFNα14 (izdelali ga je Edinburgh Protein Proizvodnja).Vse druge kemikalije in reagente so bile kupljene od Sigma Aldrich, razen če ni drugače navedeno.
Celice Flo-1 smo gojili v 6-jaminskih ploščah, naslednji dan pa smo celice 24 ur obdelali z 10 ng/ml IFNα14 do približno 80% sotočja.Celice smo trikrat sprali s PBS in ligirali s sveže pripravljenimi DSS (Thermo Fisher Scientific) (raztopljeno v DMSO) v PBS 5 minut pri 37 ° C do končne koncentracije 0,5 mM.Reakcijo DSS Crowniransing je bila nadomeščena s PBS in preostali DSS je bil ugasnjen z dodajanjem 20 mM TRIS (pH 8,0) v PBS 15 minut pri 37 ° C.Celice smo zbrali s strganjem in zbrali v nizkih vezavnih ceveh (aksik).
Celično peleto smo 30 minut pri sobni temperaturi z občasnim tresenjem lizirali s 300 ul pufra za lizo sečnine (8 m sečnine, 0,1 M Tris, pH 8,5).Vsi koraki centrifugiranja so bili izvedeni pri 14.000 xg pri 8 ° C.Lizat centrifugirajte 10 minut in supernatant prestavite v novo cev.Preostale čiste delce smo raztopili v 150 μl drugega pufra za lizo (2 m sečnine, 2% (m/v) SDS (natrijev dodecil sulfat)) 30 minut ali več, dokler ne dobimo homogene vodne raztopine.Lizat smo centrifugirali 20 minut in supernatant pomešali z lizatom, pridobljenim v prejšnjem koraku.Koncentracije beljakovin so bile ocenjene z uporabo mikro testa BCA (Thermo Fisher Scientific) v skladu z navodili proizvajalca za postopke mikroplod.Vzorci smo hitro zamrznili v tekočem dušiku in shranjeni pri -80 ° C.
Približno 100 μg topnega navzkrižno povezanega proteina smo obdelali z uporabo spremenjenega protokola za pripravo filtracije filtracije (FASP), kot je opisal Wisniewski in sod.69 Na kratko, beljakovine je zamreženo z 200 ul sečninskega pufra (8 m sečnine v 0,1 m Tris, pH 8,5), vrtinčeno in prepolovito.Vsi koraki centrifugiranja so bili izvedeni pri 14.000 xg pri 25 ° C.Prva polovica navzkrižno povezanega beljakovinskega lizata je bila prenesena v 10 kDa mikrokonsko centrifugalno filtrirno napravo, opremljeno z membrano Ultracel-10 (MERCK), ki ji je sledila centrifugiranje na filtru 25 minut.Nato v filter dodajte drugo polovico beljakovin in ponovite iste korake.Obnovitev beljakovin smo izvedli z dodajanjem 100 μl 17 mM TRIS (2-karboksietil) fosfin hidroklorid (TCEP) v sečninskem puferju.Rekuperacijo smo mešali na termomixerju pri 600 vrt./min. 30 minut pri 37 ° C.Poleg tega smo stolpec centrifugirali in zmanjšali navzkrižno vezani protein alkilirali z uporabo 100 μl 50 mM jodoacetamida v sečninskem puferju.Reakcija alkilacije smo izvedli pri sobni temperaturi 20 minut v temi.Kolumno zasukajte, stene stebre sperite 3 -krat s 100 ul sečninskega pufra in nato centrifuge.Ista operacija je bila izvedena 3 -krat z uporabo 100 μl 100 mM amonijevega bikarbonata.Pred tripsinizacijo zamenjajte zbiralno cev z novo.Dodajte prebavni pufer, ki vsebuje 50 mM amonijevega bikarbonata in 1 ul tripsina, razredčenega v puferju tripsina (Promega).Razmerje med tripsinom in beljakovinami je bilo vzdrževano pri okoli 1:33, prebavne reakcije pa inkubiramo čez noč pri 37 ° C v vlažni komori.Zamešani peptid smo s centrifugiranjem eluirali iz filtra 25 minut.Okrevanje peptidov smo izboljšali z dodajanjem 50 μl 0,5 M NaCl v filter, čemur je sledilo centrifugiranje 25 minut.
C18 mikro spin stolpci (aparat Harvard) so bili uporabljeni za desalt navzkrižno povezane triptične peptide po protokolu, ki sta ga opisala Bouchal et al.70 z manjšimi spremembami.Na kratko smo C18 vrteni stebri aktivirali s tremi pralnimi 0,1% mravljična kislina (FA) v acetonitrilu (ACN) (MERCK) in dvema pranjem 0,1% FA.Kolumna smo hidrirali z 0,1% FA 15 minut.Vzorce naložite v vrtelne stebre in 3 -krat sperite z 0,1% FA.Razsoljani peptidi smo zaporedno eluirali s postopnim gradientom z uporabo 50%, 80% in 100% ACN v 0,1% FA.Vzorce smo posušili v koncentratorju Speedvac plus (Eppendorf), dokler preostala tekočina popolnoma ni izginila.Eluirane peptide smo raztopili v 100 μl 0,08% trifluoroocetne kisline v 2,5% ACN in koncentracije izmerili na nanodrop 2000 (termo znanstveni).Približno 1 μg zamreženega peptida na vzorec smo vbrizgali v sistem LC-MS/MS.
Skrajni peptidi so bili ločeni na končnem 3000 RSLCNANO LC sistemu (Thermo Scientific), povezani z masnim spektrometrom Orbitrap Exploritis 480 (Thermo Scientific).Skrajni peptidi so bili zbrani na 300 µm ID, 5 mm dolg µ-pred-stolpec C18 zajemni stolpec, pakiran s C18 Pepmap100 sorbent in 5 µm sorbent pepmap (termo znanstveno).Naložite pretok črpalke na 5 ul/min 0,08% trifluoroocetno kislino, raztopljeno v 2,5% ACN.Križno vezani peptidi ločimo na analitičnem stolpcu s spojenim silicijevim delom z notranjim premerom 75 μm in dolžino 150 mm, napolnjene z 2 μm pepmap sorbentom (Thermo Scientific).Mobilne faze A in B so sestavljale 0,1% FA v vodi in 0,1% FA v acetonitrilu.Gradient se začne pri 2,5% B in se v 90 minutah linearno poveča na 40% B, nato na 90% B v naslednjih 2 minutah.Sestava mobilne faze je bila 10 minut vzdrževana pri 90% B, nato pa se je v 2 minutah linearno zmanjšala na 2,5% B.Stolpec je bil 8 minut pred naslednjim ciklom uravnotežen pri 2,5% B.Skrajni peptidi, eluirani iz analitičnega stolpca, so bili ionizirani v nanoelektrosprejskem ionizacijskem viru (NSI) in vbrizgali v masni spektrometer Exploritis 480 (Thermo Scientific).
Masni spektrometer Orbitrap Exploritis 480, ki deluje v pozitivnem načinu korelacije podatkov.Popolno skeniranje je bilo izvedeno v oddelku z ločljivostjo 120.000 z nastavitvami dometa od m/z 350 do m/z 2000 th.Normalizirani cilj AGC je bil nastavljen na 300% z največjim vhodnim časom 50 ms.Za peptide je bilo ugotovljeno monoizotopsko odkrivanje vrhov.Parameter za sprostitev omejitve je nastavljen na resničen, če najdemo premalo predhodnikov.Najmanjša ionska trdnost predhodnika je bila nastavljena na 5,0E3, v poskuse pa sta bila vključena stanja naboja predhodnika do +8.
Čas cikla med glavnimi pregledi v načinu korelacije podatkov je bil nastavljen na 2,5 sekunde.Dinamična izključitev mase je bila nastavljena na 20 s po prvi fragmentaciji predhodnika iona.Okno za izolacijo predhodnika je bilo nastavljeno na 2. mesto.Vrsta normalizirane energije trka s fiksnim načinom trka je bila izbrana v skeniranju MS/MS, odvisnega od podatkov.Energija trka na 30%.Ločljivost Orbitrap je bila nastavljena na 15.000, AGC pa na 100%.Čas največjega vbrizgavanja po meri je nastavljen na 60 milisekund.
Pred sledenjem beljakovinskega beljakovinskega omrežja v navzkrižnih vzorcih smo obdelali surove datoteke s pomočjo paketa Maxquant (različica 1.6.12.0) 26,27, da smo v vzorcih identificirali sledljive peptide/proteine.Poleg tega so bile podobne proteomske analize izvedene na neobveznih vzorcih Flo-1, obdelanih in neobdelanih z IFNα.Podatki MS/MS so bili iskani v človeški bazi podatkov UniProt (www.uniprot.org) (naloženo 12. avgusta 2020, vsebuje 75.093 vnosov) z uporabo vgrajenega iskalnika Andromeda27.Iskanje je bilo izvedeno, ne da bi pokazalo specifičnost encima in različne spremembe deamidacije (N, Q) in oksidacije (M).Tolerance predhodnika so bile postavljene na 20 ppm in produktne ione pri 0,02 DA.Začetno in največjo masno odstopanje je bilo nastavljeno na 10 ppm.Največja masa peptida je bila nastavljena na 4600 DA in podobnost zaporedja je bila nastavljena med 7 in 25 aminokislinami (AA).Nadaljnja statistična analiza je bila izvedena s programom Perseus (različica 1.6.10.45).Vsebnost beljakovin je bila izračunana z normalizacijo spektralne intenzivnosti beljakovin (intenzivnost LFQ; neoznačena kvantifikacija) 27 in vrednosti intenzivnosti so bile pretvorjene v LOG2.Hierarhično združevanje beljakovin, identificiranih z njihovo intenzivnostjo peptida, je bilo zgrajeno s paketom PheatMap (v1.0.12) v R (v 4.1.2).Analiza obogatitve poti je bila izvedena z uporabo baze podatkov Reactome Pathway za beljakovine, zdravljene z IFNα, ki so bili več kot štirikrat aktivirani v primerjavi z neobdelanimi vzorci.
Identifikacija lizin (K) ali serina (s) specifičnih kemičnih zamrežij beljakovinskih kompleksov, ki jih spremlja LC-MS/MS, je bila izvedena z uporabo spektroskopskega identifikacijskega stroja (SIM-XL) za navzkrižno povezane peptide (SIM-XL) 29.Prvič, možne interakcije med interferonskimi (IFN) geni za odpornost proti poškodbi DNA (IRD) so bile raziskane z uporabo podatkovnega nabora proteinov IRDS, opisanega v Padariya in sod .28.Pregled vseh pogojev in ponovitve celotnega človeškega uniprota je računsko intenzivno, zato celotna človeška baza podatkov Uniprot (www.uniprot.org) (prenesena 12. avgusta 2020, vsebuje 75.093 vnosov) proti ponovitvam, ki jih je opravila IFNα.Eden od filtrov za interakcije z visokim zaupanjem.Ti pridobljeni interakciji z visoko pomembnostjo so bili razširjeni in preizkušeni v vseh ponovitvah in pogojih.
V SIM-XL je bil uporabljen DSS za CrossLinker (XL), premik teže XL in spreminjanje teže spreminjanja pa sta bila nastavljena na 138,06 oziroma 156,07.Upoštevana so naslednja reakcijska mesta za prekrižanje: KK, KS in KN-TERM, brez reporterskih ionov.Tako predhodni kot fragment PPM sta bila nastavljena na 20, prag XREA pa na 0,15.Šteje se, da je tripsin popolnoma specifičen, in izvedena je bila visokoenergijska metoda fragmentacije C-Trap (HCD).Prag za zmanjšanje DB XCorr in najmanjše število peptidov za dinamično zmanjšanje DB sta bila nastavljena na 2,5 oziroma 2.Drugi parametri so: Monoizotopska verjetnost in največji naključni izklop, najmanj 4 ostanki AA na pramen in največji naboj pramenov ter 3 največjega zgrešenega razcepa.Nastale šivane 2D zemljevide smo analizirali v (SIM-XL) in za izdelavo 2D zemljevidov je bil uporabljen grafični prikaz XQuest28.Beljakovinske zavoje na beljakovinskih strukturah so na voljo v Pymolu (Pymol Molekularni grafični sistem, različica 2.0 Schrödinger, LLC).
Strukture beljakovinskih modelov so bile ustvarjene s pomočjo strežnika Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 z uporabo načel modeliranja homologije in izvajanja "skritega Markove metode".Phyre2 ustvarja modelne strukture, ki temeljijo na poravnavi zaporedja z znanimi beljakovinskimi strukturami.Za H2BFS smo uporabili HLA-A, HMGA1, LRCH4 in MDN1, strukture predloge 1KX552, 1KJ349, 2EZE55, 6HLU62 in 6I2665.Poleg tega je bila upoštevana tudi struktura AlphaFold71 MX1, UBP18 in Robo1.Struktura beljakovin je bila vizualizirana s paketom vizualizatorja Biovia Discovery Studio (Dassault Systèmes, Biovia, San Diego, CA, ZDA) in paket molekularnega obratovanja (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).