347 12,7*1,24 mm navita cev iz nerjavečega jekla, molekularni mehanizem sinhrone elektrostatične kondenzacije in koagregacije α-sinukleina in tau

Hvala, ker ste obiskali Nature.com.Uporabljate različico brskalnika z omejeno podporo za CSS.Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju).Poleg tega, da zagotovimo stalno podporo, spletno mesto prikažemo brez slogov in JavaScripta.
Drsniki, ki prikazujejo tri članke na diapozitiv.Uporabite gumba za nazaj in naprej, da se premikate po diapozitivih, ali pa gumbe za krmiljenje diapozitivov na koncu, da se premikate po vsakem diapozitivu.

Specifikacija cevi iz nerjavečega jekla 347

347 Zvita cev iz nerjavečega jekla 12,7*1,24 mm

Zunanji premer: 6,00 mm OD do 914,4 mm OD, velikosti do 24” NB na voljo na zalogi, jeklene cevi velikosti OD na voljo na zalogi

SS 347 Razpon debeline cevi: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S itd. (0,5-12 mm) Ali nenavadna velikost, ki se prilagodi po potrebi

Tip: SS 347 brezšivne cevi |SS 347 ERW cevi |SS 347 Varjene cevi |SS 347 izdelane cevi |Cevi SS 347 CDW, cevi LSAW / šivno varjene / prerisane

Oblika: SS 347 okrogle cevi/cevi, SS 347 kvadratne cevi/cevi, SS 347 pravokotne cevi/cevi, SS 347 zvite cevi, SS 347 "U" oblika, SS 347 Pan Cake tuljave, SS 347 hidravlične cevi

Dolžina: enojna naključna, dvojna naključna & zahtevana dolžina Konec: gladek konec, poševni konec, narezan

Končna zaščita: plastični pokrovčki |Zunanji zaključek: 2B, št. 4, št. 1, št. 8 zrcalni zaključek za cevi iz nerjavečega jekla, zaključek po zahtevah kupca

Dobavni pogoji: žarjeno in pikirano, polirano, svetlo žarjeno, hladno vlečeno

Inšpekcija, poročila o preskusih: potrdila o preskusih mlina, EN 10204 3.1, kemijska poročila, mehanska poročila, poročila o preskusih PMI, poročila o vizualnih pregledih, poročila o pregledih tretjih oseb, poročila laboratorijev, ki jih je odobril NABL, poročilo o uničujočih preskusih, poročila o nedestruktivnih preskusih

Pakiranje: Pakirano v lesene škatle, plastične vrečke, jeklene trakove v svežnju ali po zahtevah strank

Posebnosti: Velikosti in specifikacije, ki niso zgoraj, se lahko izdelajo na zahtevo

SS 347 Razpon velikosti cevi: 1/2 palca NB, OD do 24 palcev

ASTM A312 347: Brezšivne in ravne varjene avstenitne cevi, namenjene uporabi pri visokih temperaturah in splošni koroziji.Dodatna kovina med varjenjem ni dovoljena.

ASTM A358 347: Električno talilno varjene avstenitne cevi za uporabo pri jedkih in/ali visokih temperaturah.Običajno se po tej specifikaciji proizvajajo samo cevi do 8 palcev.Med varjenjem je dovoljeno dodajanje dodajne kovine.

ASTM A790 347: Brezšivne in ravne varjene feritne/avstenitne (dupleksne) cevi, namenjene splošni korozijski uporabi, s posebnim poudarkom na odpornosti na napetostno korozijsko razpokanje.

ASTM A409 347: avstenitna lahka stenska avstenitna cev velikega premera z ravnim ali spiralnim šivom varjena z električnim fuzijskim šivom v velikostih od 14" do 30" s stenama Sch5S in Sch 10S za jedko in/ali visoko

ASTM A376 347: Brezšivne avstenitne cevi za uporabo pri visokih temperaturah.

ASTM A813 347: enošivna, enojno ali dvojno varjena avstenitna cev za uporabo pri visokih temperaturah in splošno jedko.

ASTM A814 347: Hladno obdelana varjena avstenitna cev za uporabo pri visokih temperaturah in splošni koroziji.

Kemična sestava cevi iz nerjavečega jekla 347H

Mehanske lastnosti cevi iz nerjavečega jekla 347H

Fizične lastnosti cevi iz nerjavečega jekla 347H

Enakovredni razredi za cevi iz nerjavečega jekla 347H

Agregacija amiloidnega alfa-sinukleina (αS) je značilnost Parkinsonove bolezni in drugih sinukleinopatij.Pred kratkim je bil protein tau, ki je običajno povezan z Alzheimerjevo boleznijo, povezan s patologijo αS in ugotovljeno je bilo, da se lokalizira v vključkih, bogatih z αS, čeprav molekularni mehanizem koagregacije obeh proteinov ostaja nejasen.Tukaj poročamo, da se faza αS loči v tekoče kondenzate z elektrostatično kompleksno kondenzacijo s pozitivno nabitimi polipeptidi, kot je tau.Odvisno od afinitete αS do polikationov in hitrosti valentnega izčrpavanja koagulacijske mreže pride do strdkov, ki so podvrženi hitri gelaciji ali koalescenci, ki ji sledi počasna agregacija amiloida.S kombinacijo nabora naprednih biofizikalnih tehnik nam je uspelo karakterizirati ločevanje faze αS/Tau med tekočino in tekočino in identificirati ključne dejavnike, ki vodijo do tvorbe heterogenih agregatov, ki vsebujejo oba proteina v tekočem proteinskem kondenzatu.
Poleg membranskih predelkov lahko prostorsko ločitev v celicah dosežemo tudi s tvorbo z beljakovinami bogatih, tekočini podobnih gostih teles, imenovanih biomolekularni kondenzati ali kapljice, s postopkom, znanim kot ločevanje tekoče-tekočinske faze (LLPS).Te kapljice nastanejo zaradi multivalentnih časovnih interakcij, običajno med proteini ali proteini in RNK, in opravljajo različne funkcije v skoraj vseh živih sistemih.Veliko število proteinov, ki so zmožni LLP, ima zaporedja nizke kompleksnosti, ki so zelo neurejene narave in pri tvorbi biomolekularnih kondenzatov 3,4,5.Številne eksperimentalne študije so razkrile prožno, pogosto neurejeno in večvalentno naravo proteinov, ki sestavljajo te kondenzate, podobne tekočini, čeprav je malo znanega o specifičnih molekularnih determinantah, ki nadzorujejo rast in zorenje teh kondenzatov v bolj trdne oblike. država..
Novi podatki podpirajo hipotezo, da sta lahko aberantni LLPS, ki ga poganjajo beljakovine, in transformacija kapljic v trdne strukture pomembne celične poti, ki vodijo do tvorbe netopnih toksičnih agregatov, ki so pogosto znaki degenerativnih bolezni.Številni intrinzično neurejeni proteini (IDP), povezani z LLPS, pogosto zelo nabiti in fleksibilni, so že dolgo povezani z nevrodegeneracijo skozi proces agregacije amiloida.Predvsem se je pokazalo, da se biomolekularni kondenzati IDP, kot sta FUS7 ali TDP-438 ali proteini z velikimi domenami nizke kompleksnosti, kot je hnRNPA19, starajo v gelaste ali celo trdne oblike s postopkom, imenovanim fluidizacija.spojina.na prehod v trdni fazi (LSPT) kot funkcijo časa ali kot odziv na določene posttranslacijske modifikacije ali patološko pomembne mutacije1,7.
Drug IDP, povezan z LLPS in vivo, je Tau, z mikrotubulom povezan neurejen protein, katerega agregacija amiloida je bila vpletena v Alzheimerjevo bolezen10, vendar je bila nedavno vpletena tudi v Parkinsonovo bolezen (PD) in druge sinaptične jedrske proteinopatije 11, 12, 13 so povezane.Pokazalo se je, da tau spontano disociira od raztopine/citoplazme zaradi ugodnih elektrostatičnih interakcij14, kar ima za posledico tvorbo s tau obogatenih kapljic, znanih kot elektrostatični koacervati.Ugotovljeno je bilo tudi, da je ta vrsta nespecifične interakcije gonilna sila številnih biomolekularnih kondenzatov v naravi15.V primeru proteina tau se elektrostatična agregacija lahko tvori s preprosto agregacijo, pri kateri nasprotno nabite regije proteina sprožijo proces cepitve, ali s kompleksno agregacijo prek interakcije z negativno nabitimi polimeri, kot je RNA.
Pred kratkim je bil α-sinuklein (αS), amiloidni IDP, vpleten v PD in druge nevrodegenerativne bolezni, ki so skupaj znane kot sinukleinopatija 17, 18, dokazan v celičnih in živalskih modelih 19, 20, koncentriran v proteinskih kondenzatih s tekočim podobnim obnašanjem.Študije in vitro so pokazale, da je αS podvržen LLPS s preprosto agregacijo s pretežno hidrofobnimi interakcijami, čeprav ta proces zahteva izjemno visoke koncentracije beljakovin in netipično dolge inkubacijske čase 19, 21.Ali kondenzati, ki vsebujejo αS, opaženi in vivo, nastanejo s tem ali drugimi procesi LLPS, ostaja ključno nerešeno vprašanje.Podobno, čeprav so opazili agregacijo amiloida αS v nevronih pri PD in drugih sinukleinopatijah, natančen mehanizem, s katerim je αS podvržen agregaciji amiloida znotraj celice, ostaja nejasen, saj se zdi, da prekomerna ekspresija tega proteina sama po sebi ne sproži tega procesa.Pogosto so potrebne dodatne celične poškodbe, kar kaže na to, da so za renukleacijo intracelularnih amiloidnih sklopov αS potrebne nekatere celične lokacije ali mikrookolja.Eno celično okolje, ki je še posebej nagnjeno k agregaciji, je lahko notranjost proteinskih kondenzatov 23.
Zanimivo je, da je bilo ugotovljeno, da se αS in tau lokalizirata v značilnih bolezenskih vključkih pri ljudeh s Parkinsonovo boleznijo in drugimi sinukleinopatijami 24,25, poskusi pa so poročali o sinergističnem patološkem razmerju med obema proteinoma 26,27, kar kaže na potencialno razmerje med agregacijo αS in tau pri nevrodegenerativnih boleznih.bolezen.Ugotovljeno je bilo, da αS in tau medsebojno delujeta in spodbujata agregacijo drug drugega in vitro in in vivo 28,29, v možganih bolnikov s sinukleinopatijami pa so opazili heterogene agregate, sestavljene iz teh dveh proteinov 30.Vendar pa je malo znanega o molekularni osnovi interakcije med αS in tau ter mehanizmu njegove koagregacije.Poročali so, da αS medsebojno deluje s tau prek elektrostatične privlačnosti med visoko negativno nabito regijo C-terminala αS in osrednjo, s prolinom bogato regijo tau, ki je prav tako obogatena s pozitivno nabitimi ostanki.
V tej študiji smo pokazali, da lahko αS res disociira v kapljice z elektrostatično kompleksno kondenzacijo v prisotnosti proteina tau, v nasprotju z njegovo interakcijo z drugimi pozitivno nabitimi polipeptidi, kot je poli-L-lizin (pLK), in v tem procesu .αS deluje kot molekula ogrodja za mrežo kapljic.Ugotovili smo opazne razlike v procesu zorenja elektrostatičnih koacervatov αS, ki so povezane z razlikami v valenci in jakosti interakcije proteinov, vključenih v koacervatno mrežo.Zanimivo je, da smo opazili koagregacijo amiloidnih proteinov αS in tau v dolgoživih tekočih koacervatih in identificirali nekatere ključne dejavnike, ki vodijo do koagregacije teh dveh proteinov v takih koacervatih.Tukaj podrobno opisujemo ta proces, ki je možen molekularni mehanizem, na katerem temelji kolokalizacija dveh proteinov v vključkih, specifičnih za bolezen.
αS ima visoko anionski C-terminalni rep pri nevtralnem pH (slika 1a) in domnevali smo, da bi lahko bil podvržen LLPS s kondenzacijo elektrostatičnih kompleksov s polikationsko neurejenimi polipeptidnimi molekulami.Kot izhodiščno modelno molekulo smo uporabili poli-L-lizin (pLK) s 100 ostanki zaradi njegove pozitivno nabite in neurejene polimerne narave pri nevtralnem pH 32. Najprej smo potrdili, da pLK medsebojno deluje s Ct domeno αS s spektroskopijo raztopine NMR (Slika 1b) z uporabo αS, označenega s 13C/15N, v prisotnosti naraščajočih molskih razmerij αS:pLK.Interakcija pLK s Ct-domeno αS se kaže v motnjah kemijskega premika in zmanjšanju intenzivnosti vrha v tej regiji proteina.Zanimivo je, da ko smo zmešali αS s pLK pri koncentraciji αS pribl.5–25 µM v prisotnosti polietilenglikola (5–15 % PEG-8) (tipični pufer LLPS: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15 % PEG-8) smo takoj šli skozi široko polje tvorbe beljakovin .kapljice so opazili s fluorescenčno (WF) in svetlobno (BF) mikroskopijo (slika 1c).1–5 µm kapljice, ki vsebujejo koncentriran αS (dodan 1 µM αS, označen z AlexaFluor488, AF488-αS), lahko njihove elektrostatične lastnosti izpeljejo iz njihove odpornosti na 10 % 1,6-heksandiola (1,6-HD) in njegove občutljivosti na povečanje koncentracije NaCl (slika 1c).Tekočina podobna narava koacervatov elektrostatičnega kompleksa αS/pLK je prikazana z njihovo sposobnostjo zlivanja v milisekundah (slika 1d).Z uporabo turbidimetrije smo kvantificirali nastanek kapljic pod temi pogoji, potrdili elektrostatično naravo glavne interakcije, povezane z njeno stabilnostjo (slika 1e), in ovrednotili učinek različnih razmerij polimerov na proces LLPS (slika 1f).Čeprav je tvorba kapljic opažena v širokem razponu polimernih razmerij, je postopek zelo ugoden, če je pLK večji od αS.Vseživljenjsko učenje so opazili tudi z uporabo kemično drugačnega izpodrivalnega sredstva dekstran-70 (70 kDa) ali z uporabo različnih formatov vzorcev, vključno s kapljicami na stekelcih, vdolbinicami mikroplošč iz različnih materialov, Eppendorfovimi ali kvarčnimi kapilarami.
Shematski prikaz različnih beljakovinskih regij v različicah WT-αS in ΔCt-αS, uporabljenih v tej študiji.Amfipatska N-terminalna domena, hidrofobna regija, ki tvori amiloid (NAC), in negativno nabita C-terminalna domena so prikazane v modri, oranžni in rdeči barvi.Prikazan je zemljevid neto stroškov na ostanek (NCPR) za WT-αS.b NMR analiza interakcije αS/pLK v odsotnosti makromolekulskih grudic.Ko se koncentracija pLK poveča (molarna razmerja αS:pLK 1:0,5, 1:1,5 in 1:10 so prikazana v svetlo zeleni, zeleni in temno zeleni barvi).c Koacervat αS/pLK (molarno razmerje 1:10) pri 25 µM (1 µM z AF488 označenim αS ali Atto647N označenim pLK za WF slikanje) v pufru LLPS (zgoraj) ali dopolnjen s 500 mM NaCl (spodaj levo) ali po 10. % 1,6-heksandiola (1,6-HD; spodaj desno).Lestvica = 20 µm.d Reprezentativne mikroskopske slike BF kapljične fuzije αS/pLK (molarno razmerje 1:10) pri koncentraciji 25 μM;puščice označujejo zlitje posameznih kapljic (rdeče in rumene puščice) v novo kapljico (oranžna puščica) v 200 ms).Lestvica = 20 µm.e Sipanje svetlobe (pri 350 nm) αS/pLK agregacija v pufru LLPS pred in po dodatku 500 mM NaCl ali 10 % 1,6-HD pri 25 µM αS (N = 3 ponovitve vzorcev, navedena sta tudi povprečje in standardni odklon).f Slika BF (zgoraj) in analiza sipanja svetlobe (pri 350 nm, spodaj) agregacije αS/pLK pri 25 μM αS z naraščajočim molskim razmerjem αS:pLK (N = 3 ponovitve vzorcev, navedena sta tudi povprečje in standardni odklon).Lestvica = 10 µm.Vrstica merila na eni sliki označuje merilo vseh slik na eni plošči.Neobdelani podatki so na voljo v obliki neobdelanih podatkovnih datotek.
Na podlagi naših opazovanj kondenzacije elektrostatičnega kompleksa αS/pLK in prejšnjih opazovanj αS kot odjemalske molekule kondenzata tau/RNA prek neposredne interakcije s tau31 smo domnevali, da bi se lahko αS in tau sočasno ločila s topilom v odsotnosti RNA kondenzacija.prek elektrostatičnih kompleksov, αS pa je beljakovina ogrodja v koacervatih αS/Tau (glej porazdelitev naboja tau na sliki 2e).Opazili smo, da ko smo 10 μM αS in 10 μM Tau441 (ki vsebujeta 1 μM AF488-αS oziroma 1 μM Atto647N-Tau) zmešali skupaj v pufru LLPS, so zlahka tvorili beljakovinske agregate, ki vsebujejo oba proteina, kot je razvidno iz mikroskopije WF.(slika 2a).Kolokalizacija obeh proteinov v kapljicah je bila potrjena s konfokalno (CF) mikroskopijo (dopolnilna slika 1a).Podobno vedenje so opazili, ko je bil dekstran-70 uporabljen kot agregacijsko sredstvo (dopolnilna slika 1c).Z uporabo PEG ali dekstrana, označenega s FITC, smo ugotovili, da sta bila oba sredstva za gnečo enakomerno porazdeljena po vzorcih in nista pokazala niti segregacije niti povezave (dodatna slika 1d).Namesto tega nakazuje, da v tem sistemu spodbujajo ločevanje faz z učinki makromolekularne gneče, saj je PEG prednostno stabilno sredstvo za gnečo, kot je razvidno iz drugih sistemov LLP 33,34.Te kapljice, bogate z beljakovinami, so bile občutljive na NaCl (1 M), vendar ne na 1,6-HD (10% v/v), kar potrjuje njihove elektrostatične lastnosti (dodatna slika 2a, b).Njihovo obnašanje tekočine je bilo potrjeno z opazovanjem milisekundnih dogodkov združevanja kapljic z BF mikroskopijo (slika 2b).
a Konfokalne (CF) mikroskopske slike koacervatov αS/Tau441 v pufru LLPS (10 μM vsakega proteina, 0,5 μM αS, označenega z AF488, in Tau441, označenega z Atto647N).b Reprezentativne slike z diferencialnim interferenčnim kontrastom (DIC) dogodkov fuzije kapljic αS/Tau441 (10 μM za vsak protein).c Fazni diagram na podlagi sipanja svetlobe (pri 350 nm) Tau441 LLPS (0–15 µM) v odsotnosti (levo) ali prisotnosti (desno) 50 µM αS.Toplejše barve pomenijo večjo razpršenost.d Sipanje svetlobe vzorcev αS/Tau441 LLPS z naraščajočo koncentracijo αS (Tau441 pri 5 µM, N = 2–3 ponovitve vzorcev, kot je navedeno).e Shematski prikaz nekaterih različic proteina tau in različnih regij proteina, uporabljenega v tej študiji: negativno nabita N-terminalna domena (rdeča), s prolinom bogata regija (modra), domena za vezavo mikrotubulov (MTBD, poudarjeno oranžno) in parna spirala, ki tvori amiloid.filamentne regije (PHF), ki se nahajajo znotraj MTBD (sivo).Prikazan je zemljevid neto stroškov na ostanek (NCPR) za Tau441.f Z uporabo 1 µM αS, označenega z AF488, in ΔNt-, označenega z Atto647N, z uporabo 1 µM αS, označenega z AF488, ali ΔCt-αS v prisotnosti ΔNt-Tau (zgoraj, 10 µM na protein) ali K18 (spodaj, 50 µM na protein) ) ) ) mikrofotografije WF, kondenzirane v pufru LLPS ali K18.Vrstice merila na eni sliki predstavljajo merilo vseh slik na eni plošči (20 µm za plošče a, b in f).Neobdelani podatki za plošči c in d so na voljo kot neobdelane podatkovne datoteke.
Da bi preizkusili vlogo αS v tem procesu LLPS, smo najprej raziskali učinek αS na stabilnost kapljic z nefelometrijo z uporabo naraščajočih koncentracij NaCl (slika 2c).Večja kot je koncentracija soli v vzorcih, ki vsebujejo αS, višje so vrednosti sipanja svetlobe (pri 350 nm), kar kaže na stabilizacijsko vlogo αS v tem sistemu LLPS.Podoben učinek lahko opazimo s povečanjem koncentracije αS (in s tem razmerja αS:Tau441) na pribl.10-kratno povečanje glede na koncentracijo tau (5 µM) (slika 2d).Da bi dokazali, da je αS beljakovinski oder v koacervatih, smo se odločili raziskati vedenje LLPS-motenega mutanta Tau, ki nima negativno nabite N-terminalne regije (ostanki 1–150, glej sliko 2e), imenovane ΔNt-Tau.WF mikroskopija in nefelometrija sta potrdili, da sam ΔNt-Tau ni bil podvržen LLPS (slika 2f in dopolnilna slika 2d), kot je bilo prej poročano 14. Ko pa je bil αS dodan disperzijskim raztopinam te okrnjene različice Tau, je bil postopek LLPS popolnoma obnovljena z gostoto kapljic blizu gostote kapljic polne velikosti raztopin Tau in αS pri podobnih pogojih in koncentracijah beljakovin.Ta proces je mogoče opaziti tudi v pogojih nizke makromolekularne gneče (dopolnilna slika 2c).Vloga C-terminalne regije αS, vendar ne njene celotne dolžine, v procesu LLPS je bila dokazana z inhibicijo tvorbe kapljic z uporabo skrajšane različice αS na C-koncu brez ostankov 104–140 (slika 1a) (ΔCt- αS) protein (slika 2f in dopolnilna slika 2d).Kolokalizacija αS in ΔNt-Tau je bila potrjena s konfokalno fluorescenčno mikroskopijo (dopolnilna slika 1b).
Za nadaljnji preizkus mehanizma LLPS med Tau441 in αS je bila uporabljena dodatna različica Tau, in sicer fragment seznanjenega spiralnega filamentnega jedra (PHF) v domeni vezave mikrotubulov (MTBD), ki, če vsebuje štiri značilne ponavljajoče se domene, splošno znane tudi kot fragment K18 (glej sliko 2e).Nedavno so poročali, da se αS prednostno veže na protein tau, ki se nahaja v domeni, bogati s prolinom, v zaporedju, ki je pred domeno, ki veže mikrotubule.Vendar pa je regija PHF bogata tudi s pozitivno nabitimi ostanki (glej sliko 2e), zlasti z lizinom (15% ostankov), kar nas je spodbudilo k testiranju, ali ta regija prispeva tudi h kondenzaciji kompleksa αS/Tau.Opazili smo, da sam K18 ne more sprožiti LLPS pri koncentracijah do 100 μM pod testiranimi pogoji (pufer LLPS s 15 % PEG ali 20 % dekstrana) (slika 2f).Vendar, ko smo dodali 50 µM αS k 50 µM K18, smo z nefelometrijo (dopolnilna slika 2d) in WF mikroskopijo opazili hitro tvorbo beljakovinskih kapljic, ki vsebujejo K18 in αS (slika 2f).Kot je bilo pričakovano, ΔCt-αS ni mogel obnoviti obnašanja LLPS K18 (sl. 2f).Opažamo, da agregacija αS/K18 zahteva nekoliko višje koncentracije beljakovin za induciranje LLPS v primerjavi z αS/ΔNt-Tau ali αS/Tau441, če so druge stvari enake.To je skladno z močnejšo interakcijo C-terminalne regije αS z domeno Tau, bogato s prolinom, v primerjavi z domeno, ki veže mikrotubule, kot je opisano prej 31 .
Glede na to, da ΔNt-Tau ne more izvesti LLPS v odsotnosti αS, smo izbrali to različico Tau kot model za karakterizacijo αS/Tau LLPS glede na njeno preprostost v sistemih LLPS s Tau polne dolžine (izotip, Tau441/Tau441).s kompleksnimi (heterotipnimi, αS/Tau441) procesi agregacije.Primerjali smo stopnjo agregacije αS (kot del proteina kondenzirane faze, fαS,c) v sistemih αS/Tau in αS/ΔNt-Tau s centrifugiranjem in analizo SDS-PAGE disperzne faze (glej 2e), našli zelo podobne vrednosti za vse beljakovine v enaki koncentraciji.Zlasti smo dobili fαS,c 84 ± 2% oziroma 79 ± 7% za αS/Tau oziroma αS/ΔNt-Tau, kar kaže, da je heterotipska interakcija med αS in tau boljša od interakcije med molekulami tau.med.
Interakcija z različnimi polikacijami in učinek kondenzacijskega procesa na kinetiko αS sta bila najprej proučena z metodo obnovitve fluorescence po fotobeljenju (FRAP).Testirali smo koacervate αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau in αS/pLK (100 μM αS, dopolnjen z 2 μM αS AF488-αS in 100 μM Tau441 ali ΔNt-Tau ali 1 mM pLK).Podatki so bili pridobljeni v prvih 30 minutah po mešanju komponent vzorca.Iz reprezentativnih slik FRAP (sl. 3a, kondenzacija αS/Tau441) in njihovih ustreznih krivulj časovnega poteka (sl. 3b, dopolnilna slika 3) je razvidno, da je kinetika αS zelo podobna kinetiki koacervatov Tau441.in ΔNt-Tau, ki je veliko hitrejši s pLK.Izračunani difuzijski koeficienti za αS znotraj koacervata po FRAP (kot so opisali Kang et al. 35) so D = 0,013 ± 0,009 µm2/s in D = 0,026 ± 0,008 µm2/s za αS/Tau441 in αS/ΔNt- za sistem αS/.pLK, Tau in D = 0,18 ± 0,04 µm2/s (slika 3c).Vendar pa je difuzijski koeficient αS v dispergirani fazi za nekaj velikostnih redov višji od vseh kondenziranih faz, kot je določeno s fluorescenčno korelacijsko spektroskopijo (FCS, glej dodatno sliko 3) pod enakimi pogoji (pufer LLPS), vendar v odsotnosti polikationov (D = 8 ± 4 µm2/s).Zato je kinetika prevajanja αS znatno zmanjšana v koacervatih v primerjavi z beljakovinami v dispergirani fazi zaradi izrazitih učinkov molekularne gneče, čeprav vsi koacervati ohranijo lastnosti, podobne tekočini, prve pol ure po nastanku, v nasprotju s fazo tau.hitrejša kinetika v pLK kondenzatu.
a–c FRAP analiza dinamike αS (2 % αS, označenega z AF488) v elektrostatičnih koacervatih.Reprezentativne slike testov αS/Tau441 FRAP v trojniku so prikazane v (a), kjer rdeči krogi označujejo razbarvana območja.Merilna lestvica je 5 µm.b Povprečne krivulje FRAP in (c) izračunani difuzijski koeficienti (D) za 5–6 (N) različnih kapljic iz treh poskusov z uporabo 100 µM αS in ekvimolarnih koncentracij Tau441 (rdeča) ali ΔNt-Tau (modra) ali pLK (zelena) pri desetkratni koncentraciji LLPS.Standardni odklon krivulje FRAP je prikazan v senčeni barvi.Za primerjavo je bil difuzijski koeficient αS v dispergirani fazi določen v trojniku z uporabo fluorescenčne korelacijske spektroskopije (FCS) (za več informacij glejte dodatno sliko 3 in metode).d Neprekinjeni spektri EPR X-pasu 100 μM TEMPOL-122-αS v pufru LLPS brez polikationa (črno) ali v prisotnosti 100 μM Tau441 (rdeče) ali ΔNt-Tau (modro) ali 1 mM pLK (zeleno).Vložek prikazuje povečan pogled na močne poljske črte, kjer pride do najbolj dramatičnih sprememb.e Krivulje vezave 50 μM TEMPOL-122-αS z različnimi polikationi v odsotnosti LLPS (brez PEG).Pokazalo se je, da zmanjšana amplituda pasu III v primerjavi s pasom II (IIII/III) normaliziranega spektra EPR poveča molska razmerja Tau441 (rdeče), ΔNt-Tau (modro) in pLK (zeleno).Barvne črte prikazujejo prileganje podatkom z uporabo grobega modela vezave z n enakimi in neodvisnimi veznimi mesti na vsaki krivulji.Neobdelani podatki so na voljo v obliki neobdelanih podatkovnih datotek.
Kot dopolnilo smo raziskali dinamiko αS v različnih koacervatih z uporabo usmerjenega spinskega označevanja (SDSL) in kontinuirane elektronske paramagnetne resonance (CW-EPR).Ta metoda se je izkazala za zelo uporabno pri poročanju o prožnosti in dinamiki IDP z realno rezidualno ločljivostjo36,37,38.V ta namen smo konstruirali cisteinske ostanke v posameznih mutantih Cys in uporabili vrtljivo sondo 4-hidroksi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oksil (TEMPOL).Označujejo jih derivati ​​maleimida.Natančneje, vstavili smo sonde TEMPOL na položaj 122 ali 24 αS (TEMPOL-122-αS in TEMPOL-24-αS).V prvem primeru ciljamo na C-terminalno regijo proteina, ki je vključena v interakcijo s polikationi.Namesto tega nam položaj 24 lahko poda informacije o celotni dinamiki proteinov v kondenzatu.V obeh primerih so signali EPR, dobljeni za proteine ​​dispergirane faze, ustrezali nitroksidnim radikalom v hitro premikajočem se stanju.Po ločitvi faz v prisotnosti tau ali pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 ali ΔNt-Tau v razmerju 1:1 ali pLK v razmerju 1:10) so opazili povečanje relativne intenzivnosti vrha v EPR spekter αS.Linija izgube se je razširila, kar kaže na zmanjšano kinetiko preusmeritve αS v kapljicah v primerjavi z beljakovinami v razredčeni fazi (slika 3d, dopolnilna slika 4a).Te spremembe so bolj izrazite na položaju 122. Medtem ko na položaju 24 prisotnost pLK ni vplivala na kinetiko sonde, se je na položaju 122 oblika spektralne črte bistveno spremenila (dopolnilna slika 4a).Ko smo poskušali modelirati spektre na položaju 122 dveh αS/polikacijskih sistemov z uporabo izotropnega modela (dodatna slika 5a), ki se običajno uporablja za opisovanje dinamike spin-označenega IDP38, 39, nismo mogli rekonstruirati eksperimentalnih spektrov..Spektralna simulacija položaja kontrastov 24 vrtljajev (dopolnilna slika 5a).To nakazuje, da obstajajo prednostni položaji v prostoru spinskih konfiguracij C-terminalne regije αS v prisotnosti polikationov.Če upoštevamo delež αS v kondenzirani fazi pod eksperimentalnimi pogoji EPR (84 ± 2 %, 79 ± 7 % in 47 ± 4 % za αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau oziroma αS/pLK – glejte Dodatek Na sliki 2e analize podatkov c) je razvidno, da razširitev, ki jo je zaznala metoda EPR, v glavnem odraža interakcijo C-terminalne regije αS z različnimi polikationi v kondenzirani fazi (glavna sprememba pri uporabi TEMPOL-122- αS), in ne kondenzacije beljakovin.V sondi opazimo povečanje mikroviskoznosti.Kot je bilo pričakovano, je bil spekter EPR proteina pod pogoji, ki niso LLPS, popolnoma obnovljen, ko je bil mešanici dodan 1 M NaCl (dopolnilna slika 4b).Na splošno naši podatki kažejo, da spremembe, ki jih je zaznal CW-EPR, v glavnem odražajo interakcijo C-terminalne regije αS z različnimi polikationi v kondenzirani fazi, in zdi se, da je ta interakcija močnejša s pLK kot s Tau.
Da bi pridobili več strukturnih informacij o proteinih v koacervatu, smo se odločili preučiti sistem LLPS z uporabo NMR v raztopini.Vendar pa smo lahko zaznali le frakcijo αS, ki je ostala v dispergirani fazi, kar je lahko posledica zmanjšane dinamike beljakovin znotraj koacervata in goste faze na dnu raztopine v NMR analizi.Ko smo analizirali strukturo in dinamiko proteina, ki ostane v dispergirani fazi vzorca LLPS z uporabo NMR (dodatna slika 5c, d), smo opazili, da se je protein obnašal skoraj enako v prisotnosti pLK in ΔNt-Tau, oba ki so bili v sekundarni strukturi in dinamiki beljakovinskega ogrodja, razkriti s poskusi sekundarnega kemičnega premika in relaksacije R1ρ.Podatki NMR kažejo, da C-konec αS utrpi znatno izgubo konformacijske prožnosti, medtem ko ohranja svojo neurejeno naravo, tako kot preostalo proteinsko zaporedje, zaradi njegovih interakcij s polikationi.
Ker širjenje signala CW-EPR, opaženo v kondenzirani fazi TEMPOL-122-αS, odraža interakcijo proteina s polikationi, smo izvedli titracijo EPR za oceno vezavne afinitete αS na različne polikatione v odsotnosti LLPS (brez kopičenja Puffer LLPS), kar kaže, da so interakcije enake v razredčeni in koncentrirani fazi (kar potrjujejo naši podatki, dopolnilna slika 4a in dopolnilna slika 6).Cilj je bil ugotoviti, ali vsi koacervati kljub svojim skupnim lastnostim, podobnim tekočini, kažejo kakršno koli osnovno diferencialno obnašanje na molekularni ravni.Kot je bilo pričakovano, se je spekter EPR razširil z naraščajočo koncentracijo polikationa, kar odraža zmanjšanje molekularne prožnosti zaradi molekularnih interakcij vseh interakcijskih partnerjev skoraj do nasičenosti (slika 3e, dopolnilna slika 6).pLK je dosegel to nasičenost pri nižjem molskem razmerju (polikation:αS) v primerjavi z ΔNt-Tau in Tau441.Pravzaprav je primerjava podatkov s približnim vezavnim modelom ob predpostavki n enakih in neodvisnih vezavnih mest pokazala, da je navidezna disociacijska konstanta pLK (~5 μM) za red velikosti nižja kot pri Tau441 ali ΔNt-Tau (~50 μM ).µM).Čeprav je to groba ocena, to nakazuje, da ima αS večjo afiniteto za enostavnejše polikatione z neprekinjenimi regijami pozitivnega naboja.Glede na to razliko v afiniteti med αS in različnimi polikationi smo domnevali, da se lahko njihove tekoče lastnosti sčasoma spreminjajo drugače in tako trpijo zaradi različnih procesov LSPT.
Glede na zelo natrpano okolje v proteinskem koacervatu in amiloidno naravo proteina smo opazovali obnašanje koacervata skozi čas, da bi odkrili možne procese LSPT.Z uporabo mikroskopije BF in CF (slika 4) smo opazili, da αS/Tau441 v veliki meri koacervira v raztopini, pri čemer tvori velike kapljice, ki pridejo v stik in zmočijo površino na dnu jamice/stekelca kot polne kapljice, kot je bilo pričakovano (dodatna slika 7d);te spodaj oblikovane strukture imenujemo "proteinski splavi".Te strukture so ostale tekoče, saj so ohranile sposobnost spajanja (dopolnilna slika 7b) in jih je bilo mogoče videti nekaj ur po sprožitvi LLPS (slika 4 in dopolnilna slika 7c).Opazili smo, da je postopek vlaženja bolj naklonjen površini hidrofilnih kot hidrofobnih materialov (dopolnilna slika 7a), kot je pričakovano za elektrostatične koacervate z neuravnoteženimi naboji in s tem visokim elektrostatičnim površinskim potencialom.Predvsem sta se koalescenca in rafting αS/ΔNt-Tau znatno zmanjšala, medtem ko so bili kondenzati αS/pLK znatno zmanjšani (slika 4).Med kratkim inkubacijskim časom so se kapljice αS/pLK lahko združile in zmočile hidrofilno površino, vendar se je ta proces hitro ustavil in po 5 urah inkubacije so opazili le omejene dogodke koalescence in brez močenja.– prehod gel-kapanje.
Reprezentativni BF (plošče sivin) in CF (desne plošče, αS označen z AF488 v zeleni barvi) vzorcev koacervata, ki vsebujejo 100 µM αS (1 % fluorescentna oznaka) v pufru LLPS v prisotnosti 100 µM Tau441 (zgoraj) fluorescence) mikroskopske slike ΔNt -Tau (sredina) ali 1 mM pLK (spodaj) pri različnih inkubacijskih časih in goriščnih višinah (z, razdalja od dna vdolbinice plošče).Poskusi so bili ponovljeni 4-6 krat neodvisno drug od drugega z enakimi rezultati.Koacervati αS/Tau441 se po 24 urah zmočijo in tvorijo splave, večje od slike.Merilo za vse slike je 20 µm.
Nato smo vprašali, ali bi veliki tekočini podobni proteinski bazeni, ki nastanejo v αS/Tau441 LLPS, vodili do amiloidne agregacije katerega koli od proučevanih proteinov.Sledili smo zorenju kapljic αS/Tau441 skozi čas z mikroskopijo WF pod enakimi pogoji kot zgoraj, vendar z uporabo 1 μM αS, označenega z AF488, in Tau441, označenega z Atto647N (slika 5a).Kot je bilo pričakovano, smo opazili popolno lokalizacijo beljakovin v celotnem procesu zorenja.Zanimivo, od ca.Po 5 urah smo opazili intenzivnejše nekrožne strukture znotraj splavov, ki smo jih poimenovali "točke", od katerih so bile nekatere kolokalizirane z αS, nekatere pa so bile obogatene s Tau441 (sl. 5a, bele puščice).Te lise so bile vedno opažene znotraj splavov v večji meri za αS/ΔNt-Tau kot za αS/ΔNt-Tau.V kapljicah sistemov pLK in Tau, nesposobnih za fuzijo/močenje, ni bilo izrazitih madežev.Da bi preizkusili, ali so ti madeži, ki vsebujejo αS in Tau441, amiloidu podobni agregati, smo izvedli podoben poskus z uporabo CF mikroskopije, v katerem je bil Tau441 označen z Atto647N in je bilo od začetka dodano 12,5 μM amiloidno specifičnega tioflavina-T (ThT).barvilo.Čeprav ThT-obarvanje kapljic ali splavov αS/Tau441 ni bilo opaženo niti po 24 urah inkubacije (slika 5b, zgornja vrstica - preostale kapljice nad proteinskimi splavi), so bile ThT-pozitivne strukture, ki vsebujejo Atto647N-Tau441 znotraj splavov, zelo šibke.to ponovi velikost, obliko in lokacijo prej opisanih madežev (slika 5b, srednja in spodnja vrstica), kar kaže na to, da madeži morda ustrezajo amiloidu podobnim agregatom, ki nastanejo v starajočih se tekočinskih koacervatih.
WF 25 μM αS pri različnih inkubacijskih časih in goriščnih višinah (z, razdalja od nevezanega dna) v prisotnosti 25 μM Tau441 (1 μM αS, označen z AF488, in Tau441, označen z Atto647N) v vdolbinici mikroskopske plošče s pufrom LLPS) .Šest poskusov je bilo neodvisno ponovljenih s podobnimi rezultati.b Mikroskopska slika CF 25 μM αS v prisotnosti 25 μM Tau441 (1 μM Tau441, označenega z Atto647N) in 12,5 μM tioflavina-T (ThT).Utežene beljakovinske kapljice in odložene beljakovinske splavi in ​​lise so prikazane v zgornji oziroma srednji vrstici.Spodnja vrstica prikazuje slike splavov in padcev iz 3 neodvisnih ponovitev.Bele puščice označujejo THT-pozitivne pike na obeh ploščah.Merilo za vse slike je 20 µm.
Da bi podrobneje preučili spremembe v proteinskem omrežju koacervata med prehodom iz tekočine v trdno snov, smo uporabili fluorescenčno življenjsko dobo (FLIM) in Försterjevo resonančno mikroskopijo prenosa energije (FRET) (slika 6 in dodatni sliki 8 in 9).Predvidevali smo, da koacervatno zorenje plasti v bolj kondenzirano ali celo trdno agregirano proteinsko strukturo vodi do tesnejšega stika med beljakovino in fluorescentno sondo, ki je nanjo pritrjena, kar lahko povzroči učinek dušenja, ki se kaže v skrajšani življenjski dobi sonde (τ) , kot je opisano prej40.,41 ,42.Poleg tega lahko za dvojno označene vzorce (AF488 in Atto647N kot donorska oziroma akceptorska barvila FRET) to zmanjšanje τ spremlja tudi kondenzacija koacervata in povečanje učinkovitosti FRET(E) med LSPT.V vzorcih LLPS αS/Tau441 in αS/ΔNt-Tau (25 µM vsakega proteina v pufru LLPS, ki je vseboval 1 µM AF488, označenega z αS in/ali Atto647N, označenega s Tau441 ali ΔNt-Tau), smo spremljali nastajanje splavov in pik skozi čas.Opazili smo splošni trend, da se je življenjska doba fluorescence sond AF488 (τ488) in Atto647N (τ647N) rahlo zmanjšala, ko so koacervati dozoreli (slika 6 in dopolnilna slika 8c).Zanimivo je, da je bila ta sprememba znatno povečana za pike znotraj splavov (slika 6c), kar kaže, da je prišlo do nadaljnje kondenzacije beljakovin na pikah.V podporo temu niso opazili pomembne spremembe v življenjski dobi fluorescence za kapljice αS/ΔNt-Tau, stare 24 ur (dodatna slika 8d), kar kaže, da je geliranje kapljic proces, ki se razlikuje od madeža in ga ne spremlja pomembna molekularna reorganizacija znotraj koacervatov.Opozoriti je treba, da imajo pike različne velikosti in spremenljivo vsebnost v αS, zlasti za sistem αS / Tau441 (dodatna slika 8e).Zmanjšanje življenjske dobe fluorescence točke je spremljalo povečanje intenzivnosti, zlasti za Atto647N, označeno s Tau441 (dodatna slika 8a), in večja učinkovitost FRET za sisteme αS/Tau441 in αS/ΔNt-Tau, kar kaže na nadaljnjo kondenzacijo v LLPS Pet ur po sprožitvi so se proteini znotraj statične elektrike kondenzirali.V primerjavi z αS/ΔNt-Tau smo opazili nižje vrednosti τ647N in nekoliko višje vrednosti τ488 v točkah αS/Tau441, ki so jih spremljale nižje in bolj nehomogene vrednosti FRET.Verjetno je to lahko povezano z dejstvom, da je v sistemu αS/Tau441 opažena in pričakovana številčnost αS v agregatih bolj heterogena, pogosto substehiometrična v primerjavi s Tau, saj je lahko Tau441 tudi sam podvržen LLPS in agregaciji (dodatna slika 8e) .Vendar pa je stopnja koalescence kapljic, tvorba splava in, kar je pomembno, agregacija beljakovin v tekočih podobnih koacervatih največja, ko sta prisotna tako Tau441 kot αS.
slike αS/Tau441 in αS/ΔNt-Tau z doživljenjsko fluorescenčno mikroskopijo (FLIM) pri 25 μM vsakega proteina (1 μM αS, označenega z AF488, in 1 μM Tau441 ali ΔNt-Tau, označenega z Atto647N) v pufru LLPS.Stolpci prikazujejo reprezentativne slike vzorcev LLPS v različnih časih zorenja (30 min, 5 h in 24 h).Rdeči okvir prikazuje območje, ki vsebuje pike αS/Tau441.Življenjska doba je prikazana kot barvne vrstice.Lestvica = 20 µm za vse slike.b Povečana slika FLIM izbranega območja, prikazana v rdečem polju na plošči a.Življenjske dobe so prikazane z uporabo iste barvne lestvice kot na plošči a.Lestvica = 5 µm.c Histogrami, ki prikazujejo AF488 (pritrjen na αS) ali Atto647N (pritrjen na Tau) za različne proteinske vrste (kapljice-D-, raft-R- in speckle-P), identificirane na slikah FLIM, posnetih za αS-), časovne porazdelitve življenjske dobe Tau441 in Vzorci koacervata αS/ΔNt-Tau (N = 17–32 ROI za D, 29–44 ROI za R in 21–51 ROI za točke).Povprečne in mediane vrednosti so prikazane kot rumeni kvadratki oziroma črne črte znotraj polj.Spodnja in zgornja meja polja predstavljata prvi oziroma tretji kvartil, najmanjša in največja vrednost znotraj 1,5-kratnega interkvartilnega razpona (IQR) pa sta prikazani kot brki.Odstopanja so prikazana kot črni diamanti.Statistična značilnost med pari porazdelitev je bila določena z dvovzorčnim t-testom ob predpostavki neenakih varianc.Vrednosti p dvostranskega t-testa so prikazane z zvezdicami za vsak par primerjanih podatkov (* p-vrednost > 0,01, ** p-vrednost > 0,001, *** p-vrednost > 0,0001, **** p-vrednost > 0,00001), ns Označuje zanemarljivost (p-vrednost > 0,05).Natančne vrednosti p so podane v dodatni tabeli 1, izvirni podatki pa so predstavljeni kot neobdelane podatkovne datoteke.
Za nadaljnji prikaz amiloidne narave peg/agregatov smo neobarvane vzorce koacervata 24 ur obdelali z visokimi koncentracijami (1 M) NaCl, kar je povzročilo ločitev agregatov od proteinskih koacervatov.Ko smo izolirane agregate (tj. razpršeno raztopino agregatov) opazovali z mikroskopijo na atomsko silo (AFM), smo opazili pretežno sferično morfologijo z običajno višino približno 15 nm, ki se nagiba k povezovanju v pogojih visoke koncentracije soli, podobno kot obnašanje tipičnih amiloidnih fibril zaradi močnega hidrofobnega učinka na površini (upoštevajte, da imajo fibrile običajno višino ~ 10 nm) (dopolnilna slika 10a).Zanimivo je, da smo, ko smo izolirane agregate inkubirali s ThT v standardnem testu fluorescence ThT, opazili dramatično povečanje kvantnega izkoristka fluorescence ThT, primerljivo s tistim, ki smo ga opazili, ko je bilo barvilo inkubirano s tipičnimi amiloidnimi fibrili αS (dopolnilna slika 10b), kar kaže, da koacervatni agregati vsebujejo amiloidu podobne strukture..Pravzaprav so bili agregati tolerantni na visoke koncentracije soli, vendar občutljivi na 4 M gvanidin klorid (GdnHCl), kot tipične amiloidne fibrile (dopolnilna slika 10c).
Nato smo analizirali sestavo agregatov z uporabo fluorescence ene molekule, specifične fluorescenčne korelacijske/navzkrižne korelacijske spektroskopije (FCS/FCCS) in razpočne analize zaznavanja dvobarvnega naključja (TCCD).V ta namen smo izolirali agregate, ki so nastali po 24 urah inkubacije v 100 μl vzorcev LLPS, ki vsebujejo αS in Tau441 (oba 25 μM) skupaj z 1 μM αS, označenim z AF488, in 1 μM Tau441, označenim z Atto647N.Nastalo raztopino dispergiranega agregata razredčite do monomolekularnega stanja z istim pufrom brez PEG in 1 M NaCl (istim pufrom, uporabljenim za ločevanje agregatov od koacervata), da preprečite morebitne elektrostatične interakcije med LLPS in beljakovino.Primer časovne trajektorije ene same molekule je prikazan na sliki 7a.Analiza FCCS/FCS (navzkrižna korelacija, CC in avtokorelacija, AC) je pokazala, da je bilo v vzorcih veliko agregatov, ki vsebujejo αS in tau (glej krivuljo CC na sliki 7b, leva plošča), presežek preostalega monomernega proteina pa je nastal kot rezultat postopka redčenja (glejte AC krivulje na sliki 7b, levi panel).Kontrolni poskusi, izvedeni pod enakimi pogoji raztopine z uporabo vzorcev, ki vsebujejo samo monomerne proteine, niso pokazali krivulj CC, krivulje AC pa se dobro ujemajo z enokomponentnim difuzijskim modelom (Eq. 4), kjer imajo monomerni proteini pričakovane koeficiente difuzije (slika 7b ), desna plošča).Difuzijski koeficient agregiranih delcev je manjši od 1 µm2/s, monomernih proteinov pa približno 1 µm2/s.50–100 µm/s;vrednosti so podobne predhodno objavljenim vrednostim za ultrazvočno obdelane amiloidne fibrile αS in monomerni αS ločeno pod podobnimi pogoji raztopine44.Ko smo analizirali agregate z analizo eksplozije TCCD (sl. 7c, zgornja plošča), smo ugotovili, da je v vsakem izoliranem agregatu (αS/Tau heteroagregat) približno 60 % odkritih agregatov vsebovalo tako αS kot tau, približno 30 % pa le tau, le približno 10 % αS.Stehiometrična analiza heteroagregatov αS/Tau je pokazala, da je bila večina heteroagregatov obogatena s tau (stehiometrija pod 0,5, povprečno število molekul tau na agregat je 4-krat večje od molekul αS), kar je skladno z našim delom, opazovanim v FLIM in situ poskusi..Analiza FRET je pokazala, da ti agregati vsebujejo oba proteina, čeprav dejanske vrednosti FRET v tem primeru niso velikega pomena, saj je bila porazdelitev fluoroforjev v vsakem agregatu naključna zaradi presežka neoznačenega proteina, uporabljenega v poskusu.Zanimivo je, da ko smo izvedli isto analizo z uporabo različice Tau s pomanjkanjem zrele amiloidne agregacije 45,46 (glej dodatno sliko 11a,b), smo opazili, da čeprav je bila elektrostatična agregacija αS enaka (dopolnilna slika 11c, d), sposobnost tvorbe agregatov znotraj koacervata je bila drastično zmanjšana in FLIM je zaznal več točk v poskusih in situ, pri izoliranih vzorcih agregatov pa so opazili šibke krivulje navzkrižne korelacije.Vendar smo pri majhnem številu odkritih agregatov (samo ena desetina Tau441) opazili, da je bil vsak agregat obogaten z αS kot ta različica Tau, pri čemer je približno 50 % odkritih agregatov vsebovalo samo molekule αS, αS pa je bil v presežku heterogen .agregatov (glej dopolnilno sliko 11e), v nasprotju s heterogenimi agregati, ki jih ustvari Tau441 (slika 6f).Rezultati teh poskusov so pokazali, da čeprav se sam αS lahko kopiči s tau v koacervatu, je nukleacija tau ugodnejša pod temi pogoji in nastali amiloidu podobni agregati lahko delujejo kot oblika αS in tau.Ko pa se enkrat oblikuje jedro, bogato s tau, imajo heterotipske interakcije med αS in tau prednost v agregatih pred homotipskimi interakcijami med molekulami tau;opazimo tudi proteinske mreže v tekočih koacervatih αS/tau.
a Reprezentativne časovne sledi fluorescence posameznih molekul izoliranih agregatov, oblikovanih v elektrostatičnih koacervatih αS/Tau441.Izbruhe, ki ustrezajo koagregatom αS/Tau441 (izbruhi nad navedenim pragom), so opazili v treh detekcijskih kanalih (emisija AF488 in Atto647N po neposrednem vzbujanju, modre in rdeče črte, emisija Atto647N po posrednem vzbujanju), FRET, vijolična črta).b Analiza FCS/FCCS vzorca izoliranih agregatov αS/Tau441, pridobljenih iz LLPS (leva plošča).Krivulji avtokorelacije (AC) za AF488 in Atto647N sta prikazani v modri oziroma rdeči barvi, krivulje navzkrižne korelacije (CC), povezane z agregati, ki vsebujejo obe barvili, pa so prikazane v vijolični barvi.Krivulje AC odražajo prisotnost označenih monomernih in agregiranih proteinskih vrst, medtem ko krivulje CC kažejo samo difuzijo dvojno označenih agregatov.Ista analiza, vendar pod enakimi pogoji raztopine kot na izoliranih mestih, so vzorci, ki vsebujejo samo monomerni αS in Tau441, prikazani kot kontrole na desni plošči.c Fluorescenčna bliskovita analiza posameznih molekul izoliranih agregatov, oblikovanih v elektrostatičnih koacervatih αS/Tau441.Informacije za vsak agregat, najden v štirih različnih ponovitvah (N = 152), so prikazane glede na njihovo stehiometrijo, vrednosti S in učinkovitost FRET (zgornja plošča, barvna vrstica odraža pojav).Ločimo lahko tri vrste agregatov: -αS-samo agregati s S~1 in FRET~0, Tau-samo agregati s S~0 in FRET~1 ter heterogeni Tau/αS agregati z vmesnim S in FRET Ocene količine obeh markerskih proteinov, odkritih v vsakem heterogenem agregatu (N = 100), so prikazani na spodnji plošči (barvna lestvica odraža pojav).Neobdelani podatki so na voljo v obliki neobdelanih podatkovnih datotek.
Poročali so, da je zorenje ali staranje tekočih beljakovinskih kondenzatov v gelaste ali trdne strukture sčasoma vključeno v več fizioloških funkcij kondenzata47 kot tudi v bolezen, kot nenormalen proces pred agregacijo amiloida 7, 48, 49. Tukaj podrobno preučujemo ločitev faz in obnašanje.LSPT αS v prisotnosti naključnih polikationov v nadzorovanem okolju pri nizkih mikromolarnih koncentracijah in fiziološko pomembnih pogojih (upoštevajte, da je izračunana fiziološka koncentracija αS >1 µM50), po tipičnem termodinamično vodenem obnašanju LPS.Ugotovili smo, da je αS, ki vsebuje visoko negativno nabito C-terminalno regijo pri fiziološkem pH, sposoben tvoriti z beljakovinami bogate kapljice v vodni raztopini preko LLPS v prisotnosti visoko kationskih neurejenih peptidov, kot sta pLK ali Tau, skozi proces elektrostatične kompleksna kondenzacija v prisotnosti agregacijskih makromolekul.Ta proces ima lahko pomembne učinke v celičnem okolju, kjer αS naleti na različne polikationske molekule, povezane z njegovo z boleznijo povezano agregacijo tako in vitro kot in vivo 51, 52, 53, 54.
V mnogih študijah je bila dinamika beljakovin znotraj kapljic obravnavana kot eden od ključnih dejavnikov, ki določajo proces zorenja 55, 56.V elektrostatičnih koacervatih αS s polikationi je proces zorenja očitno odvisen od moči interakcij s polikationi, valence in množice teh interakcij.Teorija ravnotežja nakazuje, da bi bila ravnovesna pokrajina dveh tekočih stanj prisotnost velike kapljice, bogate z biopolimeri, ki poganjajo LLPS57,58.Rast kapljic je mogoče doseči z Ostwaldovim zorenjem59, koalescenco60 ali porabo prostega monomera v dispergirani fazi61.Za αS in Tau441, ΔNt-Tau ali pLK je bila večina beljakovin koncentrirana v kondenzatu pod pogoji, uporabljenimi v tej študiji.Medtem ko so se kapljice tau v polni velikosti hitro združile po površinskem omočenju, sta bila koalescenca in omočenje kapljic težavna za ΔNt-Tau in pLK, kar kaže na hitro izgubo lastnosti tekočine v teh dveh sistemih.Glede na našo analizo FLIM-FRET so stare kapljice pLK in ΔNt-Tau pokazale podobno stopnjo agregacije beljakovin (podobno življenjsko dobo fluorescence) kot prvotne kapljice, kar kaže, da je bila prvotna beljakovinska mreža ohranjena, čeprav bolj toga.
Naše eksperimentalne rezultate racionaliziramo v naslednjem modelu (slika 8).Prvotno začasno oblikovane kapljice so pogosto proteinske mreže brez elektrostatične kompenzacije, zato obstajajo področja neravnovesja naboja, zlasti na vmesniku kapljic, kar ima za posledico kapljice z visokim elektrostatičnim površinskim potencialom.Za kompenzacijo naboja (pojav, ki se običajno imenuje valenčna deplecija) in minimiziranje površinskega potenciala kapljic, lahko kapljice vključujejo nove polipeptide iz razredčene faze, reorganizirajo proteinske mreže za optimizacijo interakcij naboja in naboja in sodelujejo z drugimi kapljicami.s površinami (močenje).Zdi se, da lahko kapljice αS/pLK zaradi enostavnejše proteinske mreže (samo heterotipske interakcije med αS in pLK) in večje afinitete za interakcije protein-protein hitreje uravnotežijo naboj kondenzata;dejansko smo opazili hitrejšo kinetiko beljakovin v prvotno oblikovanih koacervatih αS/pLK kot pri αS/Tau.Po izčrpanju valence postanejo interakcije manj kratkotrajne in kapljice izgubijo svoje tekoče lastnosti ter se spremenijo v gelaste, negorljive kapljice z nizkim elektrostatičnim površinskim potencialom (in zato ne morejo zmočiti površine).Nasprotno pa so kapljice αS/Tau manj učinkovite pri optimizaciji ravnovesja naboja kapljic zaradi bolj zapletenih beljakovinskih mrež (s homotipskimi in heterotipskimi interakcijami) in šibkejše narave beljakovinskih interakcij.Posledica tega so kapljice, ki dalj časa ohranjajo tekoče obnašanje in kažejo visok elektrostatični površinski potencial, ki se nagiba k zmanjšanju z združevanjem in rastjo (s čimer se zmanjša razmerje med površino in prostornino kapljic) in z vlaženjem hidrofilne površinske kemikalije.To ustvarja velike koncentrirane beljakovinske knjižnice, ki ohranijo tekoče lastnosti, saj interakcije ostanejo zelo prehodne zaradi nenehnega iskanja optimizacije naboja v proteinski mreži.Zanimivo je, da N-terminalno okrnjene oblike Tau, vključno z nekaterimi naravno prisotnimi izooblikami62, kažejo vmesno obnašanje, pri čemer se nekateri koacervati starajo z αS v dolgožive gelaste kapljice, medtem ko se drugi spremenijo v velike tekoče kondenzate.Ta dvojnost pri zorenju elektrostatičnih koacervatov αS je skladna z nedavnimi teoretičnimi in eksperimentalnimi študijami LLPS, ki so odkrile korelacijo med zmanjšanjem valence in elektrostatičnim sejanjem v kondenzatih kot ključno za nadzor velikosti kondenzata in lastnosti tekočine.Mehanizem 58.61.
Ta shema prikazuje domnevno pot agregacije amiloida za αS in Tau441 prek LLPS in LSPT.Z dodatnimi regijami, bogatimi z anioni (rdeča) in bogatimi s kationi (modra), imajo elektrostatični koacervati αS in tau z zadovoljivo valenco nižjo površinsko energijo in zato manj koalescence, kar povzroči hitro staranje kapljic.Doseženo je stabilno neaglomerirano stanje gela..Ta situacija je zelo ugodna v primeru sistema αS/pLK zaradi njegove večje afinitete in enostavnejše mreže interakcij proteinskih parov, ki omogoča hiter gelasti prehod.Nasprotno, kapljice z nezadovoljivo valenco in zato z beljakovinami nabitimi regijami, ki so na voljo za interakcijo, olajšajo koacervatu, da se zlije in zmoči hidrofilno površino, da se zmanjša njegova visoka površinska energija.Ta situacija je boljša za koacervate αS/Tau441, ki imajo večvalentno kompleksno mrežo, sestavljeno iz šibkih interakcij Tau-Tau in αS-Tau.Po drugi strani pa bodo večji koacervati lažje obdržali svoje tekoče lastnosti, kar bo omogočilo druge interakcije med beljakovinami.Sčasoma se znotraj koacervatne tekočine oblikujejo amiloidni heterogeni agregati, ki vsebujejo tako αS kot tau, kar je lahko povezano s tistimi v inkluzijskih telescih, ki so znaki nevrodegenerativnih bolezni.
Velike strukture, podobne tekočini, ki nastanejo med zorenjem αS/Tau441 z zelo preobremenjenim, a dinamičnim proteinskim okoljem in v manjši meri koacervati αS/ΔNt-Tau, so idealni rezervoarji za nukleacijo agregacije beljakovin.Dejansko smo opazili nastanek trdnih beljakovinskih agregatov v tej vrsti beljakovinskih koacervatov, ki pogosto vsebujejo tako αS kot tau.Pokazali smo, da so ti heteroagregati stabilizirani z neelektrostatičnimi interakcijami, da lahko vežejo za amiloid specifična ThT barvila na enak način kot tipične amiloidne fibrile in imajo dejansko podobno odpornost na različne vplive.Pokazalo se je, da imajo agregati αS/tau, ki jih tvori LLPS, lastnosti, podobne amiloidu.Dejansko je zrela različica Tau s pomanjkanjem amiloidne agregacije znatno oslabljena pri tvorbi teh heterogenih agregatov αS znotraj tekočega elektrostatičnega koacervata.Tvorba agregatov αS/Tau441 je bila opažena samo znotraj koacervatov, ki so ohranili lastnosti, podobne tekočini, in nikoli, če koacervati/kapljice niso dosegli stanja gela.V slednjem primeru povečana moč elektrostatičnih interakcij in posledično togost proteinskega omrežja preprečita potrebne konformacijske preureditve proteinov za vzpostavitev novih proteinskih interakcij, potrebnih za nukleacijo amiloida.Vendar pa je to mogoče doseči v bolj prožnih, tekočini podobnih koacervatih, za katere je bolj verjetno, da bodo ostali tekoči, ko se povečajo.
Dejstvo, da je tvorba agregatov znotraj kondenzirane faze boljša pri velikih kondenzatih αS/Tau kot pri majhnih kapljicah, ki hitro želirajo, poudarja pomembnost prepoznavanja dejavnikov, ki nadzorujejo koalescenco kapljic.Tako ne obstaja le težnja po ločevanju faz, ampak je treba nadzorovati velikost kondenzata za pravilno delovanje in preprečevanje bolezni58,61.Naši rezultati prav tako poudarjajo pomen ravnotežja med LLPS in LSPT za sistem αS/Tau.Medtem ko lahko tvorba kapljic ščiti pred agregacijo amiloida z zmanjšanjem količine proteinskih monomerov, ki so na voljo v pogojih nasičenja, kot je bilo predlagano v drugih sistemih 63, 64, lahko fuzija kapljic pri visokih ravneh kapljic povzroči notranjo agregacijo beljakovin s počasnimi konformacijskimi preureditvami.proteinske mreže..
Na splošno naši podatki močno poudarjajo pomen kohezivne valence in zadovoljnih/nezadovoljenih interakcij v padajočih omrežjih v kontekstu LSPT.Zlasti pokažemo, da se kondenzati αS/Tau441 polne dolžine lahko učinkovito spajajo in nukleirajo, da tvorijo amiloidu podobne heteroagregate, ki vključujejo oba proteina, in predlagajo molekularni mehanizem, ki temelji na naših eksperimentalnih rezultatih.Ko-agregacija dveh proteinov v koacervatu tekočine αS/Tau, o kateri poročamo tukaj, je morda res povezana s so-lokalizacijo dveh proteinov v vključkih, ki sta znaka bolezni, in lahko prispeva k razumevanju odnosa med LLPS in agregacije amiloida, ki utira pot visoko nabitemu IDP pri nevrodegeneraciji.
Monomerne WT-αS, cisteinske mutante (Q24C-αS, N122C-αS) in različice ΔCt-αS (Δ101-140) so bile izražene v E. coli in očiščene, kot je opisano prej.5 mM DTT je bil vključen v vse korake čiščenja αS cisteinskih mutantov, da se prepreči tvorba disulfidne vezi.Izoforma Tau441 (plazmid pridobljen iz Addgene #16316), različica ΔNt-Tau (Δ1–150, pridobljena s kloniranjem IVA s primerji CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) in različica AggDef-Tau (Δ275–311, prečiščena z GGCTC 5 primer) Kulture E. coli so bile zrasel na OD600 = 0,6–0,7 pri 37 °C in 180 obratih na minuto, izražanje pa je bilo inducirano z IPTG 3 ure pri 37 °C.Celice pobiramo pri 11.500 xg 15 minut pri 4 °C in speremo s slanim pufrom, ki vsebuje 150 mM NaCl.Peleto resuspendirajte v pufru za lizo (20 ml na 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidin 50 µM, kopeptin 100 µM).Korak sonikacije je bil izveden na ledu z amplitudo 80 % za 10 impulzov (1 min vklopljen, 1 min izklopljen).Pri enem ultrazvoku ne presezite 60 ml.Lizate E. coli smo segrevali pri 95 °C 20 minut, nato ohladili na ledu in centrifugirali pri 127.000 × g 40 minut.Očiščen supernatant smo nanesli na 3,5 kDa membrano (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, Združeno kraljestvo) in ga dializirali proti 4 L dializnega pufra (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM , PMSF 0,1 mM) 10 ur.5 ml kationsko izmenjevalno kolono (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, ZDA) smo uravnotežili z ekvilibracijskim pufrom (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Tau lizat smo filtrirali skozi 0, 22 μm PVDF filter in vbrizgali v kolono s hitrostjo pretoka 1 ml / min.Elucija je potekala postopoma, tau je bil eluiran s 15–30 % elucijskim pufrom (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Frakcije smo analizirali s SDS-PAGE in vse frakcije, ki vsebujejo en pas s pričakovano molekulsko maso tau, koncentriramo z uporabo 10 kDa centrifugirnega filtra in nadomestimo s pufrom, ki vsebuje 10 mM HEPES, pH 7,4, NaCl 500 mM in DTT 2 mM za končna koncentracija beljakovin je bila 100 μM.Proteinsko raztopino smo nato spustili skozi 0,22 μm PVDF filter, hitro zamrznili in shranili pri -80 °C.Protein K18 je prijazno zagotovil prof. Alberto Boffi.Čistost pripravka je bila >95 %, kar je potrjeno s SDS-PAGE in MALDI-TOF/TOF.Različni cisteini so bili kemično označeni z AlexaFluor488-maleimidom (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ZDA) ali TEMPOL-maleimidom (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada).so bili potrjeni z absorbanco in MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau in K18 smo označili z naravnimi cisteinskimi ostanki na mestih 191 in 322 z uporabo Atto647N-maleimida (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Nemčija) po istem postopku.Karte neto naboja na ostanke za αS in Tau441 so bile ustvarjene z uporabo CIDER66.
Trden poli-L-lizin (pLK DP 90-110 glede na NMR od dobavitelja, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, ZDA) je bil raztopljen v 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, koncentracija pH 7,4 do 10 mM, proces sonikiran 5 minut v ultrazvočni vodni kopeli in hranite pri -20 °C.PEG-8, dekstran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, ZDA) in FITC-dekstran-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, ZDA) so vodotopni in široko porazdeljeni v pufru LLPS.Dializa odstrani kontaminirane soli.Nato smo jih filtrirali skozi filter na brizgo z velikostjo por 0,22 μm in njihove koncentracije izračunali z refraktometrom (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, ZDA).Vzorce LLPS smo pripravili pri sobni temperaturi v naslednjem vrstnem redu: pufer in ekstruzijo smo zmešali ter 1 mM tris(2-karboksietil)fosfina (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(etan- 1,2-diildinitril) tetraocetne kisline (EDTA, karboksint) in mešanice 1 % zaviralca proteaz (PMSF 100 mM, benzimid 1 mM, leveptin 5 μM).Nato se dodajo αS in kondenzirani polikationi (možnosti pLK ali Tau).Za poskuse s časovnimi serijami tioflavina-T (ThT, Carbosynth, Compton, Združeno kraljestvo) uporabite skupno koncentracijo ThT tako, da je polovica koncentracije αS.Nežno, a temeljito premešajte vzorce, da zagotovite, da so homogeni.Koncentracija vsake komponente se je razlikovala od poskusa do poskusa, kot je opisano v razdelku z rezultati.Azid je bil uporabljen v koncentraciji 0,02 % (w/v), kadar koli je trajanje poskusa preseglo 4 ure.Za vse analize z uporabo vzorcev LLPS pustite, da se mešanica pred analizo 5 minut uravnoteži.Za analizo sipanja svetlobe smo 150 µl vzorcev naložili na nezavezujoče mikroplošče s 96 vdolbinicami (µClear®, črna, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Avstrija) in prekrili z lepilnim filmom.LLP smo spremljali z merjenjem absorbance pri 350 nm v središču raztopine v bralniku plošč CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Nemčija).Poskusi so bili izvedeni v treh izvodih pri 25 °C, napake pa so bile izračunane kot standardni odklon od povprečja.Razredčeno fazo smo kvantificirali s centrifugiranjem vzorca in analizo gela SDS-PAGE, frakcijo αS v razredčeni in koncentrirani fazi pa smo kvantificirali v različnih raztopinah LLPS.100 μl vzorec LLPS, ki je vseboval 1 μM αS, označenega z AF488, smo pripravili s temeljitim mešanjem, ki mu je sledilo centrifugiranje pri 9600 × g 30 minut, po katerem je bila oborina običajno vidna.Zgornjih 50 μl supernatanta smo uporabili za kvantifikacijo beljakovin z uporabo SDS-PAGE gela.Geli so bili skenirani s filtri AF488 z uporabo sistema za slikanje z gelom ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, ZDA) ali obarvani z madežem Coomassie in vizualizirani z ustreznimi filtri.Nastale pasove smo analizirali z uporabo ImageJ različice 1.53i (National Institutes of Health, ZDA).Poskusi so bili izvedeni v dvojniku v dveh različnih poskusih s podobnimi rezultati.
Običajno je bilo 150 μl vzorcev nanesenih na nezavezujoče mikroplošče s 96 jamicami in vizualiziranih pri sobni temperaturi na invertnem mikroskopu Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Nemčija).Za točkovne poskuse so bile uporabljene tudi plošče µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Nemčija) ali polistirenske mikroplošče s 96 jamicami (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).Kot vir osvetlitve so bile uporabljene halogenske ali živosrebrove metalhalogenidne žarnice EL6000 (za slikanje BF/DIC oziroma WF).Za mikroskopijo WF je bil uporabljen zračni objektiv s 40-kratno povečavo (Leica Microsystems, Nemčija) za fokusiranje svetlobe na vzorec in njegovo zbiranje.Za vzorce z oznako AF488 in ThT filtrirajte vzbujanje in emisijo s standardnimi kompleti filtrov GFP, pasovnoprepustnimi filtri za vzbujanje in emisijo, pasovnoprepustnimi filtri 460–500 nm oziroma 512–542 nm ter dihroičnim zrcalom 495 nm.Za vzorce, označene z Atto647N, je bil uporabljen standardni nabor filtrov Cy5 z vzbujevalnimi in emisijskimi pasovnimi filtri 628–40 nm oziroma 692–40 nm ter 660 nm dihroično ogledalo.Za mikroskopijo BF in DIC uporabite isti objektiv za zbiranje odbite svetlobe.Zbrana svetloba je bila posneta na kamero Leica DFC7000 CCD (Leica Microsystems, Nemčija).Čas osvetlitve je bil 50 ms za BF in DIC mikroskopsko slikanje in 20-100 ms za WF mikroskopsko slikanje.Za primerjavo je bil čas izpostavljenosti za vse poskuse s THT 100 ms.Izvedeni so bili poskusi s časovnim zamikom, da bi vizualizirali koalescenco kapljic, slike pa so bile zbrane vsakih 100 ms nekaj minut.Za analizo slike je bil uporabljen ImageJ (NIH, ZDA).Poskusi so bili izvedeni v treh izvodih s podobnimi rezultati.
Za poskuse kolokalizacije, FRAP in 3D rekonstrukcijo so bile slike pridobljene na invertnem konfokalnem mikroskopu Zeiss LSM 880 z modro izdajo ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Nemčija).Vzorce po 50 µl smo nanesli na petrijevke µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Nemčija), obdelali s hidrofilnim polimerom (ibiTreat) in vgradili v 63× oljni imerzijski objektiv (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) na DIC).Slike so bile pridobljene z uporabo argonskih laserskih linij 458 nm, 488 nm in 633 nm z ločljivostjo 0,26 µm/piksel in časom osvetlitve 8 µs/piksel za okna zaznavanja vzbujanja in emisij 470–600 nm, 493–628 nm, in 638–755 nm je bil uporabljen za vizualizacijo ThT, AF488 oziroma Atto647N.Za poskuse FRAP je bila fotografija vsakega vzorca s časovnim zamikom posneta pri 1 sličici na sekundo.Poskusi so bili izvedeni v treh izvodih pri sobni temperaturi s podobnimi rezultati.Vse slike so bile analizirane s programsko opremo Zen 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Nemčija).Krivulje FRAP so bile normalizirane, narisane in prilagojene podatkom o intenzivnosti/času, ekstrahiranim iz slik z uporabo Zen 2 z OriginPro 9.1.Krivulje okrevanja so bile prilagojene monoeksponentnemu modelu za upoštevanje molekularne difuzije z dodatnim eksponentnim členom za upoštevanje učinka beljenja pridobitve.Nato smo izračunali D z uporabo nominalnega polmera beljenja in predhodno določene razpolovne dobe obnovitve kot v enačbi Kang et al.5 35 prikazano.
Posamezne cisteinske različice αS so bile sintetizirane s 4-hidroksi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oksilom (TEMPOL) na mestih 24 (TEMPOL-24-αS) in 122 (TEMPOL-122-αS), oz.Označevanje z vrtenjem Za poskuse EPR je bila koncentracija αS nastavljena na 100 μM, koncentracija PEG pa 15 % (w/v).Za različne agregacijske pogoje je bilo razmerje αS:pLK 1:10, medtem ko sta bila razmerja αS:ΔNt-Tau in αS:Tau441 ohranjena pri 1:1.Za poskuse titracije vezave v odsotnosti gneče je bil TEMPOL-122-αS vzdrževan pri 50 μM in polikationi so bili titrirani pri naraščajočih koncentracijah, pri čemer je bil vsak pogoj pripravljen posebej.Meritve CW-EPR so bile izvedene s spektrometrom X-pasu Bruker ELEXSYS E580, opremljenim z resonatorjem Bruker ER4118 SPT-N1, ki deluje pri mikrovalovni (SHF) frekvenci ~9,7 GHz.Temperatura je bila nastavljena na 25 °C in nadzorovana s kriostatom s tekočim dušikom.Spektri so bili pridobljeni v nenasičenih pogojih pri MW moči 4 mW, amplitudi modulacije 0,1 mT in frekvenci modulacije 100 kHz.Spektralne intenzivnosti so bile normalizirane, da bi se izognili razlikam v koncentracijah vrtenja med vzorci in možnemu zmanjšanju vrtenja zaradi preostalih koncentracij reducentov v vzorcih, ki vsebujejo Tau441 ali ΔNt-Tau (prisoten v prvotnih raztopinah beljakovin).Dane vrednosti g so bile pridobljene kot rezultat spektralnega modeliranja EPR, izvedenega s programsko opremo Easyspin (v. 6.0.0-dev.34), implementirano v Matlab®67.Za modeliranje podatkov so bili uporabljeni eno/dvokomponentni izotropni modeli.Po normalizaciji vseh signalov so bili ostanki izračunani z odštevanjem vsake simulacije od ustreznega eksperimentalnega spektra.Za analizo titracije vezave je bila za spremljanje vezave polikationov na αS uporabljena relativna intenzivnost tretjega pasu proti drugemu pasu normaliziranega spektra EPR (IIII/III).Za oceno disociacijske konstante (Kd) je bila nastala krivulja prilagojena približnemu modelu ob predpostavki n enakih in neodvisnih vezavnih mest.
Eksperimenti NMR spektroskopije so bili izvedeni z uporabo NMR spektrometra Bruker Neo 800 MHz (1H), opremljenega s kriosondo in Z-gradientom.Vsi poskusi so bili izvedeni z uporabo 130–207 µM αS in ustreznih αS/ΔNt-Tau in pLK ekvivalentov v 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 % DO, pH 7,4 in so bili izvedeni pri 15 °C.Za spremljanje LPS z NMR smo vnaprej zmešanim vzorcem dodali 10 % PEG.Graf perturbacije kemijskega premika (slika 1b) prikazuje povprečne kemijske premike 1H in 15N.Spektri αS 2D1H-15N HSQC so bili dodeljeni na podlagi prejšnje dodelitve (vnos BMRB št. 25227) in potrjeni s snemanjem in analizo 3D spektrov HNCA, HNCO in CBCAcoNH.Kemični premiki 13Cα in 13Cβ so bili izračunani v prisotnosti ΔNt-Tau ali pLK za merjenje možnih sprememb v trendih sekundarne strukture v primerjavi s kemičnimi premiki αS v čisti naključni konformaciji tuljave 68 (dodatna slika 5c).Stopnje R1ρ so bile izmerjene s snemanjem eksperimentov hsqctretf3gpsi (pridobljenih iz knjižnice Bruker) z zakasnitvami 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 in 800 ms, eksponentne funkcije pa so bile prilagojene zakasnitvam največje intenzivnosti pri različnih časi za določitev R1ρ in njegove eksperimentalne negotovosti.
Poskusi dvobarvne časovno ločljive fluorescenčne mikroskopije so bili izvedeni na komercialnem časovno ločljivem fluorescenčnem konfokalnem mikroskopu MT200 (PicoQuant, Berlin, Nemčija) z napravo za štetje posameznih fotonov s časovno korelacijo (TCSPC).Glava laserske diode se uporablja za impulzno prepleteno vzbujanje (PIE), žarek gre skozi enomodni valovod in je nastavljen na moč laserja od 10 do 100 nW za laserske črte 481 nm in 637 nm, izmerjene po dihroičnem zrcalu.To zagotavlja optimalno hitrost štetja fotonov, s čimer se izognemo učinkom aliasinga fotonov, fotobeljenja in nasičenosti.Pokrovnice ali plošče za angiogenezo μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Nemčija) so bile postavljene neposredno v potopno vodo nad lečo Super Apochromat 60x NA 1.2 s korekcijskim ovratnikom (Olympus Life Sciences, Waltham, ZDA).Kot razdelilnik glavnega žarka je bilo uporabljeno dihroično zrcalo 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, ZDA).Nefokusirano sevanje blokira luknja s premerom 50 mikronov, nato pa se fokusirano sevanje razdeli na 2 zaznavni poti z razdelilnikom žarkov 50/50.Pred detektorjem so bili uporabljeni pasovni emisijski filtri (Semrock, Lake Forest, IL, ZDA) 520/35 za zeleno barvilo (AF488) in 690/70 za rdeče barvilo (Atto647N).Kot detektorji so bile uporabljene enofotonske lavinske diode (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italija).Zbiranje in analiza podatkov sta bili izvedeni s komercialno dostopno programsko opremo SymphoTime64 (PicoQuant GmbH, Berlin, Nemčija).
Petdeset mikrolitrov vzorcev LLPS smo nanesli na vdolbinice za angiogenezo μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Nemčija).Dobljene slike so fokusirane na 20 µm nad dnom vrtine za optimalno objektivno delovno razdaljo za suspendirane kapljice in na ~1 µm za splave in pike z aksialno ločljivostjo najmanj 0,25 µm/piksel in zakasnitvijo 400 µs/piksel.Izberite podatke z uporabo praga intenzivnosti, ki temelji na povprečni intenzivnosti signala v ozadju (PBG, povprečje + 2σ) za vsak kanal, tako da so izbrane samo kapljice tekočih beljakovin, splavi ali lise, pri čemer se izloči vsak možen izvor iz razpršene faze.Za analizo življenjske dobe vsake vrste (τ) vsakega kanala (zelena, "g" za AF488 in rdeča, "r" za Atto647N) smo izbrali območja zanimanja (ROI), ki vsebujejo kapljice, splave ali lise (dodatna slika 1 ).8b) in jih izpeljal tako, da je prilagodil razpad njihove življenjske dobe (τD, τR in τP za kapljice, splave ali lise, glej dodatno sliko 8c) v vsakem kanalu z uporabo analize prileganja repa in dvokomponentnega modela razpada.Povprečje τ iz τ .ROI, ki so proizvedli premalo fotonov za večeksponentno prileganje, so bili izključeni iz analize.Uporabljena meja je bila <104 fotonov za splave in pike ter 103 za kapljice.Kapljice imajo nižji prag, ker je težko dobiti razpadne krivulje z višjimi vrednostmi intenzitete, saj so kapljice v slikovnem polju običajno manjše in jih je manj.ROI s številom fotonov nad mejo kopičenja fotonov (nastavljeno na >500 štetij/piksel) so bili prav tako zavrženi za analizo.Ujemite krivuljo upada intenzivnosti, dobljeno iz območja zanimanja, z intenzivnostjo pri 90 % maksimuma (nekoliko za največjo intenzivnostjo upadanja) od začetka življenjske dobe, da zagotovite minimalne motnje IRF, hkrati pa ohranite enako za vse upade intenzivnosti nastavitve Relativno časovno okno Analiziranih je bilo 25 do 50 ROI za splave in lise ter 15-25 ROI za padce, slike, izbrane iz več kot 4 ponovitev, posnetih iz vsaj 3 neodvisnih poskusov.Za ovrednotenje statističnih razlik med vrstami ali med koacervatnimi sistemi so bili uporabljeni dvostranski t-testi.Za analizo življenjske dobe po pikslovih (τ) je bilo izračunano skupno slabljenje življenjske dobe v polju za vsak kanal in izvedena je bila aproksimacija 2/3-komponentnega modela eksponentnega slabljenja.Duljenje življenjske dobe za vsako slikovno piko je bilo nato prilagojeno z uporabo predhodno izračunanih vrednosti τ, kar je povzročilo psevdobarvno FLIM fit sliko.Razpon življenjske dobe prileganja repa je bil enak na vseh slikah istega kanala in vsak razpad je proizvedel dovolj fotonov, da je zagotovil zanesljivo prileganje.Za analizo FRET so bile piksle izbrane z uporabo nižjega praga intenzivnosti 100 fotonov, kar je pomenilo povprečje signala ozadja (FBG) 11 fotonov.Intenzivnost fluorescence vsakega kanala je bila popravljena z eksperimentalno določenimi korekcijskimi faktorji: 69 spektralni presluh α je bil 0,004, neposredno vzbujanje β je bilo 0,0305, učinkovitost detekcije γ je bila 0,517.Učinkovitost FRET na ravni slikovnih pik se nato izračuna z naslednjo enačbo:
kjer je FDD intenzivnost fluorescence, opažena v donorskem (zelenem) kanalu, FDA je intenzivnost fluorescence, opažena v akceptorskem (rdečem) kanalu pri posrednem vzbujanju, FAA pa je intenziteta fluorescence, opažena v akceptorskem (rdečem) kanalu pri neposrednem vzbujanju ( PITA).V kanalu opazimo impulze intenzivnosti fluorescence).
Postavite 100 µl reakcijskih raztopin LLPS, ki vsebujejo 25 µM neoznačenega monomernega Tau441 (z ali brez 25 µM αS) v pufru LLPS (dopolnjenem kot zgoraj) na nezavezujoče mikroplošče s 96 vdolbinicami z lepljivo prevleko iz folije in tvorbo kapljic preverite z WF mikroskopijo po uravnoteženje.v 10 min.Po 48 urah inkubacije pri sobni temperaturi je bila potrjena prisotnost beljakovinskih splavov in madežev.Nato previdno odstranite tekočino nad splavi iz vdolbinic, nato dodajte 50 L disociacijskega pufra (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) in inkubirajte 10 minut.Visoka koncentracija soli zagotavlja, da se LLPS ne bo ponovil zaradi ostankov PEG, možni proteinski sklopi, ki nastanejo le z elektrostatičnimi interakcijami, pa bodo razstavljeni.Dno vdolbinice smo nato previdno postrgali s konico mikropipete in nastalo raztopino prenesli v prazno opazovalno vdolbinico.Po 1-urni inkubaciji vzorcev s 50 μM ThT smo preverili prisotnost izoliranih madežev z WF mikroskopijo.Pripravite ultrazvočno obdelana vlakna αS tako, da 7 dni inkubirate 300 µl 70-µM raztopine αS v PBS s pH 7,4, 0,01 % natrijevim azidom pri 37 °C in 200 obratih na minuto na orbitalnem stresalniku.Raztopino smo nato centrifugirali pri 9600 × g 30 minut, pelet resuspendirali v PBS pH 7,4 in sonikirali (1 min, 50 % cikel, 80 % amplituda v ultrazvočnem aparatu Vibra-Cell VC130, Sonics, Newton, ZDA) vzorce vlaken. z relativno enakomerno porazdelitvijo velikosti majhnih vlaken.
Analiza FCS/FCCS in zaznavanje dvobarvnega naključja (TCCD) sta bili izvedeni na istem časovno ločljivem fluorescentnem konfokalnem mikroskopu MT200 (Pico-Quant, Berlin, Nemčija), ki je bil uporabljen za mikroskopske poskuse FLIM-FRET z uporabo načina PIE.Moč laserja za te poskuse je bila dodana na 6,0 µW (481 nm) in 6,2 µW (637 nm).Kombinacija teh laserskih moči je bila izbrana za ustvarjanje podobne svetlosti za uporabljene pare fluoroforjev, hkrati pa doseganje optimalnih hitrosti štetja in izogibanje fotobeljenju in nasičenju.Zbiranje in analiza podatkov sta bila izvedena s komercialno dostopno programsko opremo SymphoTime64 različice 2.3 (PicoQuant, Berlin, Nemčija).
Vzorce izoliranih agregatov αS/Tau, pridobljenih z uporabo LLPS, razredčimo v izolacijskem pufru na ustrezno monomolekularno koncentracijo (običajno razredčitev 1:500, saj so agregati že v nizkih koncentracijah, ko so izolirani iz vzorcev koacervata).Vzorci so bili naneseni neposredno na pokrovna stekelca (Corning, ZDA), predhodno premazana z raztopino BSA v koncentraciji 1 mg/mL.
Za analizo PIE-smFRET v zelenih in rdečih kanalih je bil uporabljen nižji prag intenzivnosti 25 fotonov za filtriranje signalov nizke intenzivnosti, ki jih povzročajo monomerni dogodki (upoštevajte, da je število monomerov večje od združenih vzorcev v primerjavi z izoliranimi agregati).Ta prag je bil izračunan kot petkratna povprečna intenzivnost monomernega αS, pridobljenega z analizo vzorcev čistega monomera, da bi se posebej izbrali agregati za analizo.Pogonsko vezje PIE je skupaj z zajemom podatkov TSCPC omogočilo uporabo življenjskega utežnega filtra, ki pomaga odpraviti ozadje in spektralne presluhe.Intenzivnost izbruha, izbrana z uporabo zgornjih pragov, je bila popravljena z uporabo povprečnega signala ozadja, določenega iz histogramov pojavljanja v primerjavi z intenzivnostjo/bin vzorcev, ki vsebujejo samo pufer.Izbruhi, povezani z velikimi agregati, običajno zasedejo več zaporednih binov v časovni sledi (nastavljeni na 1 ms).V teh primerih je bil izbran zaboj z največjo močjo.Za FRET in stehiometrično analizo je bil uporabljen teoretično določen faktor gama γ (0,517).Prispevki spektralnega presluha in neposrednega vzbujanja so zanemarljivi (določeno eksperimentalno) pri uporabljeni moči vzbujalnega laserja.Učinkovitost in stehiometrija FRET v eksploziji se izračuna na naslednji način.