ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Dvostransko varjena cev za kemično industrijo, kemična komponenta, pomanjkanje SPECC1L vodi do povečane stabilnosti spojenih spojev in zmanjšanega izločanja celic kranialnega nevralnega grebena.

Hvala, ker ste obiskali Nature.com.Uporabljate različico brskalnika z omejeno podporo za CSS.Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju).Poleg tega, da zagotovimo stalno podporo, spletno mesto prikažemo brez slogov in JavaScripta.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex varjene cevi za kemično industrijo

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.je vodilni proizvajalec, ki je specializiran za brezšivne cevi iz nerjavečega jekla, svetlo žarjene cevi, brezšivne zvite cevi itd.Da bi olajšali kupcem, smo varili tudi cevi.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.ima najnaprednejšo opremo za proizvodnjo in testiranje.Popolnoma lahko izpolnimo vaše zahteve.V skladu z zelo strogim standardom imajo cevi, ki jih proizvajamo pri nas, vedno pravilno toleranco OD in WT.Kontrola tolerance je strogo v skladu s standardi proizvodnje.Z našimi izdelki so stranke vedno zadovoljne.Kupci, ki so kupili naše izdelke, so ustvarili več dobička.
a) OD (zunanji premer): 3,18 mm do 101,6 mm
b) WT (debelina stene): 0,5 mm do 20 mm
c) Dolžina: glede na zahtevo stranke
d) Standardi: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 itd
e) Metoda postopka: ERW, EFW itd

Drsniki, ki prikazujejo tri članke na diapozitiv.Uporabite gumba za nazaj in naprej, da se premikate po diapozitivih, ali pa gumbe za krmiljenje diapozitivov na koncu, da se premikate po vsakem diapozitivu.
Celice kranialnega nevralnega grebena (CNCC) se odtrgajo od embrionalnih živčnih gub in migrirajo v faringealne loke, ki tvorijo večino struktur srednjega obraza.Disfunkcija CNCC ima pomembno vlogo v etiologiji orofacialne razjede, pogoste prirojene malformacije.Heterozigotne mutacije SPECC1L so odkrili pri bolnikih z atipičnimi in sindromskimi razcepi.Tukaj poročamo o izboljšanem obarvanju komponent kanoničnega adhezivnega spoja (AJ), β-katenina in E-kadherina v gojenih knockdown celicah SPECC1L, elektronske mikrografije pa kažejo apikalno-bazalno difuzijo AJ.Da bi razumeli vlogo SPECC1L v kraniofacialni morfogenezi, smo ustvarili model miši s pomanjkljivostjo Specc1l.Homozigotni mutanti so smrtni za zarodek in kažejo oslabljeno zapiranje nevralne cevi in ​​laminacijo CNCC.Obarvanje beljakovin AJ je povečano v mutantnih živčnih gubah.Ta napaka AJ je skladna z napako v delaminaciji CNCC, ki zahteva raztapljanje AJ.Poleg tega so mutanti Specc11 zmanjšali signalizacijo PI3K-AKT in povečali apoptozo.In vitro je bila blaga inhibicija signalizacije PI3K-AKT v celicah divjega tipa zadostna za induciranje sprememb AJ.Pomembno je, da je mogoče spremembe AJ, ki jih povzroči knockdown SPECC1L, obrniti z aktivacijo poti PI3K-AKT.Ti podatki skupaj kažejo, da je SPECC1L kot nov regulator signalizacije PI3K-AKT in biologije AJ potreben za zapiranje nevralne cevi in ​​stratifikacijo CNCC.
Celice kranialnega nevralnega grebena (CNCC) se lokalizirajo na dorzalnem nevroektodermu in se ločijo od nevroepitelija razvijajočih se nevralnih gub skozi proces, ki vključuje epitelno-mezenhimski prehod (EMT) 1,2,3.Premigrirajoči epitelijski CNCC prekinejo medcelične stike in postanejo selitveni mezenhimski CNCC, ki zapolnjujejo prvi in ​​drugi faringealni lok in tvorijo večino kraniofacialnega hrustanca.Tako so geni, ki uravnavajo delovanje CNCC, pogosto moteni v etiologiji kraniofacialnih prirojenih anomalij, kot so orofacialne razpoke, ki najpogosteje prizadenejo 1/800 rojstev samo v ZDA.Ena od prirojenih deformacij8.
Delaminacija CNCC sovpada z zaprtjem sprednje nevralne cevi med 8,5 in 9,5 dni embrionalnega razvoja pri miših.Mutanti številnih genov, povezanih z mišjo orofacialno razcepko, kažejo tudi neko obliko okvare nevralne cevi, vključno z Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 in Pdgfrα12.Vendar se procesi zapiranja nevralne cevi in ​​stratifikacije CNCC lahko štejejo za neodvisne, saj mutantna miš Splotch (Pax3) kaže napake pri zapiranju nevralne cevi brez kakršnega koli vpliva na stratifikacijo ali migracijo CNCC 13,14.Dodatni mišji modeli z napakami v disekciji CNCC in zaprtju nevralne cevi bodo pomagali razmejiti skupno molekularno osnovo teh dveh procesov.
Izolacija CNCC iz nevroepitelnih celic zahteva raztapljanje adhezivnih spojin (AJ), ki so sestavljeni iz proteinskih kompleksov, ki med drugim vsebujejo E-kadherin, β-katenin, α-E-katenin in α-aktinin, povezane z aktinskimi filamenti 2 Študije prekomerne ekspresije E-kadherina v nevralnih gubah so pokazale zmanjšanje ali zakasnitev delaminacije CNCC.Nasprotno pa zatiranje E-kadherina povzroči zgodnjo stratifikacijo15,16.Številni dejavniki, ki posredujejo EMT med stratifikacijo CNCC, so transkripcijski faktorji (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) in beljakovine za preoblikovanje zunajceličnega matriksa (ECM), kot so matrične metaloproteinaze (MMP), vendar so CNCC neposredni citoskeletni regulatorji AJ. še ni znano.Znano je, da pot PI3K-AKT antagonizira ravni E-kadherina, predvsem iz raziskav raka17.Nedavne študije so pokazale, da izguba signalizacije PI3K-AKT na osnovi PDGFα pri miših vodi do kraniofacialnih nenormalnosti, vključno z razcepom neba in okvarami nevralne cevi12.Vendar pa razmerje med potjo PI3K-AKT in stabilnostjo AJ pri stratifikaciji CNCC ni jasno.
Prej smo identificirali SPECC1L kot prvi mutirani gen pri dveh osebah s hudo razcepom, ki sega od ust do očesa, znano kot poševna razcepka (ObFC) ali Tessier IV18 razcep.Mutacije SPECC1L so bile identificirane v dveh večgeneracijskih družinah z avtosomno dominantnim sindromom Opitz G/BBB (OMIM št. 145410), v katerih so prizadeti posamezniki pokazali hiperdistanco in razcepko ustnico/nepce19, in v eni družini s sindromom prevelike razdalje Tibi (OMIM št. 145420)20 .več kot polovica primerov sindroma Opitz G/BBB je povezanih z X (OMIM #300000) in jih povzročajo mutacije v genu MID1, ki kodira protein 22 celičnega skeleta, povezanega z mikrotubulami.Domnevamo, da lahko SPECC1L, prav tako protein, povezan z mikrotubuli in aktinskim citoskeletom, posreduje signalizacijo, potrebno za preoblikovanje aktinskega citoskeleta med celično adhezijo in migracijo 18.S študijami in vitro in in vivo zdaj opisujemo SPECC1L kot nov regulator stabilnosti AJ prek signalizacije PI3K-AKT.Na celični ravni je pomanjkanje SPECC1L povzročilo znižanje ravni proteina pan-AKT in povečanje apikalno-bazalne disperzije AJ, ki je bila odpravljena s kemično aktivacijo poti AKT.In vivo zarodki s pomanjkanjem Specc11 kažejo oslabljeno zaprtje nevralne cevi in ​​zmanjšano disekcijo CNCC.Tako SPECC1L deluje v visoko regulirani signalizaciji na osnovi celične adhezije, ki je potrebna za normalno delovanje CNCC med morfogenezo obraza.
Za karakterizacijo vloge SPECC1L na celični ravni smo uporabili predhodno opisano stabilno celično linijo osteosarkoma U2OS s pomanjkanjem SPECC1L18.Te stabilne celice U2OS s knockdownom SPECC1L (kd) so imele zmerno (60–70 %) znižanje ravni transkriptov in proteinov SPECC1L, skupaj z napakami v migraciji in reorganizaciji aktinskega citoskeleta 18. Nasprotno pa je prišlo do hudega prehodnega zmanjšanja Pokazalo se je, da SPECC1L povzroča mitotične napake 23.Po nadaljnji karakterizaciji smo ugotovili, da so naše stabilne celice SPECC1L-kd spremenile morfologijo pri zelo visoki stopnji konfluence (slika 1).Posamezne kontrolne celice in kd celice pri nizki konfluenci so bile videti podobno (slika 1A, D).24 ur po fuziji so kontrolne celice ohranile svojo kuboidno obliko (sl. 1B, E), medtem ko so se celice SPECC1L-kd podaljšale (sl. 1C, F).Obseg te spremembe oblike celic je bil zajet s slikanjem kontrolnih celic in celic kd in vivo v živo (film 1).Da bi določili vlogo SPECC1L v konfluentnih celicah, smo najprej pregledali njegovo izražanje.Ugotovili smo, da so se ravni proteina SPECC1L po fuziji povečale (slika 1G), medtem ko se ravni transkriptov SPECC1L niso povečale (slika 1H).Poleg tega se je s povečevanjem gostote celic protein SPECC1L kopičil na medceličnih mejah (sl. 2A-E), pri čemer se je vzorec prekrival z vzorcem β-katenina, povezanega z membrano (sl. 2A'-E').Glede na povezavo SPECC1L z aktinskim citoskeletom 18, 23 smo domnevali, da SPECC1L medsebojno deluje z adhezivnimi spoji (AJ) na osnovi aktina.
(AF) SPECC1L knockdown (DF) celice se pri visoki konfluenci (F) podaljšajo v primerjavi s kontrolnimi celicami U2OS (AC).Tukaj so prikazane tri od šestih časovnih točk (T1, T3, T6), ki smo jih izbrali za različne gostote celic.(G) Western blot analiza, ki kaže, da je protein SPECC1L stabiliziran pri visoki stopnji konfluence v primerjavi z nizko stopnjo konfluence v kontrolnih celicah.Western blot SPECC1L kaže pričakovan pas 120 kDa in pas z višjo molekulsko maso, po možnosti posttranslacijsko spremenjen (*).Western blot analiza je bila izvedena pod enakimi pogoji za nizko in visoko sotočje.Slike, ki prikazujejo SPECC1L pri nizki in visoki konfluenci, so bile vzete iz istega madeža.Isti madež smo odstranili in ponovno pregledali s protitelesom proti β-aktinu.(H) Kvantitativna analiza RT-PCR ni pokazala pomembnih sprememb ravni transkripta SPECC1L.Vrstice napak predstavljajo SEM iz štirih neodvisnih poskusov.
(AE) Izbrali smo šest časovnih točk (T1-T6), ki predstavljajo razpon gostote celic za normalizacijo analize oblike celic in sprememb AJ v celicah U2OS s knockdown SPECC1L (kd).Prvih pet od teh časovnih točk je vključevalo posamezne celice (T1), 50-70 % fuzijo majhnih celičnih grozdov (T2), fuzijo brez preoblikovanja kd celic (T3), preoblikovanje kd celic (T4) in 24-urne spremembe.v posteriorni obliki celic kd (T5).Protein SPECC1L je bil pretežno razpršen v citoplazmi pri T1 (A), vendar so njegovo kopičenje opazili na medceličnih mejah v naslednjih časovnih točkah (B–E, puščice).(FJ) β-katenin kaže podobno kopičenje na medceličnih mejah, povezanih s kompleksom AJ.(A'-E') SPECC1L in β-katenin kažeta prekrivajoče se obarvanje na mejah celic pri visoki gostoti celic (puščice).(F'-J') V celicah SPECC1L-kd je obarvanje β-katenina videti normalno pri nizki gostoti celic (F'-H'), vendar se razširi, ko se oblika celice spremeni (I', J'; puščice), kar kaže, da je AJ se je spremenilo.Palice = 10 µm.
Nato smo poskušali ugotoviti učinek pomanjkanja SPECC1L na AJ.Uporabili smo več markerjev, povezanih z AJ, vključno s kanoničnimi komponentami F-aktin, miozin IIb, β-katenin in E-kadherin 24, 25, 26, 27.Aktinska stresna vlakna so se povečala v celicah SPECC1L-kd, kot je opisano prej (sl. 3A, B) 18.Miozin IIb, povezan z aktinskimi filamenti, je pokazal podobno povečanje celic SPECC1L-kd in vitro (sl. 3C, D).β-katenin, povezan z AJ, se veže na kadherin na celični membrani, kar kaže normalen vzorec izražanja "satja" v kontrolnih kubocitih (sl. 3E, G).Zanimivo je, da je na ravnih slikah z uporabo konfokalne mikroskopije obarvanje β-katenina (sl. 3E, F) in E-kadherina (sl. 3G, H) na celični membrani konfluentnih celic s pomanjkanjem SPECC1L pokazalo vidne vzorce razširjenega obarvanja.Ta ekspanzija obarvanja β-katenina, povezanega z AJ, v celicah kd je bila najbolj izrazita pri sotočju, vendar se je zdelo, da je pred spremembami v obliki celice (sl. 2F-J, F'-J').Da bi določili fizično naravo tega razširjenega obarvanja z AJ, smo s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) pregledali celične meje na apikalno-bazalni površini celic SPECC1L-kd U2OS (slika 3I,J).V nasprotju s kontrolnimi celicami (slika 3I), ki so imele ločena področja z elektronsko gostoto, ki kažejo na AJ (puščice), so celice kd (slika 3J) pokazale velika, sosednja območja z visoko gostoto elektronov, ki kažejo na AJ vzdolž apikobazalne ravnine..Poleg tega smo na prečnih odsekih opazili obsežne gube celične membrane v kd celicah (sl. S1A, B), kar pojasnjuje razširjen vzorec pasov obarvanja β-katenina in E-kadherina (sl. 3F, H).V podporo vlogi SPECC1L pri AJ je bil β-katenin soimunoprecipitiran s SPECC1L v lizatih konfluentnih celic U2OS (slika 3K).Skupaj z razširjenim imunskim barvanjem za markerje AJ je bila analiza TEM skladna z našo hipotezo, da pomanjkanje SPECC1L poveča apikalno-bazalno gostoto in varianco AJ.
(AH) Povečano obarvanje F-aktina v kd celicah 48 ur po fuziji (T6; A, B).Spremenjeno obarvanje miozina IIb, povezano s F-aktinom (C, D).Gladek vzorec obarvanja membrane β-katenina in E-kadherina v kontrolnih celicah (E, G) je bil izboljšan v celicah SPECC1L-kd (F, H).Palice = 10 µm.(I–J) Elektronske mikrografije, ki opazujejo apikalno-bazalni medcelični stik.Kontrolne celice kažejo različna področja z elektronsko gostoto, ki kažejo na lepljive spoje (I, puščice).V nasprotju s tem se je celoten apikalno-bazalni spoj v celicah SPECC1L-kd zdel elektronsko gost (J, puščice), kar kaže na povečano gostoto in disperzijo adhezivnih stikov.(K) β-katenin je bil soimunoprecipitiran s SPECC1L v konfluentnih celičnih lizatih U2OS.Slika, posneta z enega mesta, ki predstavlja enega od štirih neodvisnih poskusov.
Da bi razumeli vlogo SPECC1L v kraniofacialni morfogenezi, smo ustvarili mišji model s pomanjkljivostjo Specc1l z uporabo dveh neodvisnih celičnih linij pasti ES, DTM096 in RRH048 (BayGenomics, CA), ki predstavljata intron 1, transkripti Specc1l pa so bili zajeti pri 15 (slika 1) .4A, slika S2).Genomsko lokacijo vabnega vektorskega vložka smo določili s sekvenciranjem celotnega genoma in potrdili s PCR (slika S2).Obe zasnovi genske pasti sta omogočili tudi fuzijo poročevalcev Specc11-lacZ v okvirju po zajemanju.Zato je bila ekspresija lacZ, določena z barvanjem z X-gal, uporabljena kot indikator ekspresije Specc11.Oba alela sta pokazala podobne vzorce ekspresije lacZ, pri čemer je genska past DTM096 v intronu 1 pokazala močnejšo ekspresijo kot RRH048 v intronu 15 (ni prikazano).Vendar pa je Specc1l močno izražen, s posebej močnim izražanjem v nevralnih gubah na E8.5 (slika 4B), v nevralni cevi in ​​obraznih procesih na E9.5 in E10.5 (slika 4C, D) in v razvijajočih se udih na E10.5 in oči (slika 4D).Prej smo poročali, da je bila ekspresija SPECC1L v prvem faringealnem loku pri E10.5 prisotna v epiteliju in spodnjem mezenhimu18, skladno z linijo CNCC.Za testiranje ekspresije SPECC1L v CNCC smo izvedli nevronske gube E8.5 (slika 4E-J) in E9.5 dele lobanje (slika 4K-).Pri E8.5 je SPECC1L intenzivno obarval nevralne gube (slika 4E, H), vključno s celicami, obarvanimi z markerji NCC (slika 4G, J).Pri E9.5 je SPECC1L (sl. 4K, N) močno obarval selitveni CNCC, sočasno obarvan z AP2A (sl. 4L, M) ali SOX10 (sl. 4O, P).
(A) Shematski prikaz mišjega gena Specc11, ki prikazuje vstavljanje vabnega vektorja v celične klone ES DTM096 (intron 1) in RRH048 (intron 15).(BD) lacZ barvanje heterozigotnih zarodkov Specc1lDTM096, ki predstavlja ekspresijo Specc1l od E8.5 do E10.5.NE = nevroektoderm, NF = nevralna guba, PA1 = prvi faringealni lok.(EP) Imunsko barvanje SPECC1L z NCC markerjema AP2A in SOX10 v živčnih gubah E8.5 (NF; EJ) in delih lobanje E9.5 (KP).Barvanje SPECC1L je bilo široko opaženo v nevralnih gubah E8.5 (E, H; konice puščice), vključno s celicami, označenimi z AP2A (F, G; konice puščice) in SOX10 (I, J; konice puščice).Pri E9.5 je SPECC1L močno obarval selitvene CNCC (K, N; puščice), označene z AP2A (L, M; puščice) in SOX10 (O, P; puščice).
Križanje med heterozigotnimi mišmi Specc1lDTM096/+ in Specc1lRRH048/+ kaže, da alela pasti gena nista komplementarna in da so sestavljeni heterozigoti in embrionalni homozigoti za kateri koli alel pasti gena smrtni za zarodek (tabela S1).Mendelska razmerja so pokazala zmanjšanje stopnje preživetja heterozigotov ob rojstvu (pričakovano 1,34 v primerjavi z 2,0).Opazili smo nizko perinatalno smrtnost med heterozigoti, nekateri so imeli kraniofacialne anomalije (slika S3).Vendar pa nizka penetracija teh perinatalnih kraniofacialnih fenotipov otežuje preučevanje njihovih osnovnih patofizioloških mehanizmov.Zato smo se osredotočili na embrionalni smrtonosni fenotip homozigotnih mutantov Specc11.
Večina sestavljenih heterozigotnih ali homozigotnih mutantnih zarodkov Specc1lDTM096/RRH048 se ni razvila po E9.5–10.5 (sliki 5A–D) in nevralna cev se ni zaprla spredaj (sliki 5B, D) in včasih zaprla zadaj (ni prikazano) ..Ta okvara zaprtja kranialne nevralne cevi je bila povezana z večino CNCC označenega DLX2, ki je ostal v nevralnih gubah pri E10.5, kar kaže na odsotnost disekcije (slika 5A'-D').Da bi ugotovili, ali se je tudi skupna velikost CNCC zmanjšala, smo linije CNCC označili z GFP v naših linijah genskih pasti z Wnt1-Cre in ROSAmTmG.Pretakamo razvrščene GFP+ NCC in GFP- (RFP+) ne-NCC iz celih zarodkov.Pri E9.5 se delež pretočno razvrščenih CNCC, označenih z GFP, ni bistveno spremenil med WT in mutiranimi zarodki (ni prikazano), kar kaže na normalno specifikacijo CNCC.Zato smo domnevali, da je preostalo obarvanje Wnt1-Cre in DLX2 v izpostavljenih nevralnih gubah (slika 5B') posledica okvarjenega plastenja CNCC, verjetno zaradi povečane gostote ali disperzije celic AJ, kot je razvidno iz celic SPECC1L-kd.Uporabili smo markerje NCC SOX10, AP2A in DLX2, da potrdimo prisotnost CNCC v nevralni gubi (slika 5E-R).Pri E8.5 so opazili obarvanje nevralne gube za vse tri markerje NCC v odsekih WT (sl. 5E, G, I) in mutanta Specc1l (sl. 5F, H, J).Pri E9.5, medtem ko so markerji NCC obarvali selitveni NCC v odsekih WT (sl. 5M, O, Q), so opazili preostalo obarvanje NCC v izpostavljenih živčnih gubah mutantnih zarodkov Specc1l (sl. 5N, P, R).Ker SOX10 in DLX2 označujeta selitvene CNCC, ta rezultat nakazuje, da CNCC s pomanjkanjem SPECC1L dosežejo specifikacijo po selitvi, vendar ne migrirajo iz živčnih gub.
Pomanjkanje Specc11 vodi do okvarjenega zaprtja nevralne cevi, delaminacije celic lobanjskega živčnega grebena in AJ.
(A, B') E9.5 WT (A) Zarodek, ki nosi selitvene celice kranialnega nevralnega grebena (CNCC), označene z Wnt1-Cre (A').Nasprotno pa mutirani zarodki Specc11 kažejo odprte živčne gube (B), konice puščice) in CNCC, ki se niso preselili (B', konice puščice).(C, D') Slike svetlega polja (C, D') in imunsko barvanje (C', D') markerja CNCC DLX2 zarodkov E10.5 WT (C, C') in Specc1l (D, D').Pri zarodkih WT E10.5 DLX2-pozitivni CNCC kolonizirajo škržne loke (C', puščice), medtem ko pri mutantih vidno obarvanje ostane v odprtih nevralnih gubah (D', puščice) in v prvih faringealnih lokih (D', puščice).) z nekaj obarvanja (puščice), ki kaže na slabo razslojevanje in migracijo CNCC.ER) Odseki mutantnih zarodkov WT in Specc1l na stopnjah E8.5 (E–L) in E9.5 (M–R) so bili označeni z NCC markerji SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) in DLX2 (I, J, Q, R).Pri E8.5 so opazili obarvanje NCC v nevralni gubi divjega tipa (NF) in mutantnih odsekih.Sočasno obarvanje SOX10 in β-katenina v E8.5 WT (K) in mutantu (L) je pokazalo povečano obarvanje β-katenina na celičnih mejah v nevralnih gubah.Pri E9.5 so opazili obarvanje divjega tipa selitvenih CNCC (M, O, Q), medtem ko so pri mutantih nestratificirani CNCC obarvali odprte nevralne gube (N, P, R).(S–Z) In vivo analiza označevanja AJ v koronarnih odsekih zarodkov WT in Specc11DTM096/RRH048 z mutacijo E9.5.V zgornjem desnem kotu je prikazana približna presečna ravnina.V odsekih mutiranih tkiv so opazili povečano obarvanje F-aktina (S, T) in miozina IIb (U, V).Podobno kot rezultati in vitro na sliki 3 so pri mutantnih zarodkih opazili okrepljeno obarvanje membrane za β-katenin (W, X) in E-kadherin (Y, Z).(AA-BB) Elektronska mikrofotografija dela zarodka divjega tipa, ki gleda čez mejo apikalno-bazalne celice, kaže izrazito elektronsko gosto regijo, ki kaže na adhezivne stike (AA, puščice).Nasprotno pa je v odsekih mutantnih zarodkov Specc11 (BB, puščice) celoten apikobazalni spoj gost elektronov, kar kaže na povečano gostoto in disperzijo adhezivnih stikov.
Da bi preizkusili našo hipotezo, da je zmanjšano plastenje posledica spremenjenega AJ, smo pregledali označevanje AJ v izpostavljenih živčnih gubah Specc1l mutantnih zarodkov (sl. 5S-Z).Opazili smo povečanje aktinskih stresnih vlaken (sl. 5S, T) in sočasno povečano lokalizacijo obarvanja miozina IIB na aktinskih vlaknih (sl. 5U, V).Pomembno je, da smo opazili povečano obarvanje β-katenina (sl. 5W, X) in E-kadherina (sl. 5Y, Z) na medceličnih mejah.Preučili smo tudi obarvanje NCC z β-kateninom v nevralnih gubah zarodkov E8.5 (slika 5K, L).Zdi se, da je barvanje z β-kateninom močnejše v mutantnih nevronskih gubah Specc1l (sl. 5L in K), kar kaže, da so se začele spremembe AJ.Na elektronskih mikrofotografijah lobanjskih odsekov zarodkov E9.5 smo ponovno opazili povečano difuzno obarvanje z elektronsko gostoto pri mutantnih zarodkih Specc1l v primerjavi z WT (sl. 5AA, BB in S1E-H).Ti rezultati skupaj podpirajo naše rezultate in vitro v celicah SPECC1L-kd U2OS in kažejo, da je nenormalno obarvanje AJ pred stratifikacijo CNCC v naših mutiranih zarodkih.
Glede na znano antagonistično razmerje med aktivnostjo AKT in stabilnostjo E-kadherina,17,28 smo domnevali o vpletenosti signalizacije PI3K-AKT.Poleg tega smo opazili subepidermalne mehurje pri nekaterih naših mutiranih zarodkih, ki so se izognili smrtnosti (<5 %) pri E9,5-10,5 in so se namesto tega ustalili pri okoli E13,5 (slika S3).Subepidermalni vezikli so znak zmanjšane signalizacije PI3K-AKT na podlagi PDGFRα12.Fantauzzo idr.(2014) so ​​poročali, da motnje aktivacije PI3K na osnovi PDGFRα v mutantnih zarodkih PdgfraPI3K/PI3K povzročijo subepidermalne vezikle, okvare nevralne cevi in ​​fenotipe razcepa neba.Dejansko so bile ravni pan-AKT in aktivnega fosforiliranega Ser473-AKT zmanjšane in vivo v mutantnih tkivih Specc1l do zaustavitve zarodka E9.5 (sl. 6A-D).Zmanjšanje ravni fosforiliranega Ser473-AKT je lahko v celoti posledica znižanja ravni pan-AKT in vivo (slika 6E) in in vitro (slika 6F).Zmanjšanje in vitro so opazili le, ko so bile celice U2OS močno konfluentne s spremembami v obliki celic in gostoti AJ (slika 6D).Tako naši podatki kažejo, da je SPECC1L nov pozitivni regulator signalizacije PI3K-AKT v kraniofacialni morfogenezi.
(A–E) E8.5 (A,B) in E9.5 (C,D) odseki lobanje ali E9.5 lizati mutantnih zarodkov Specc1l (E), ki kažejo ravni aktivnega fosforiliranega zmanjšanja beljakovin S473-AKT in pan-AKT , v primerjavi s kontrolnim WT.Western blot je bil izveden na lizatih divjega tipa in mutantnih lizatih pod enakimi pogoji.Prikazane slike za SPECC1L so bile vzete iz enega madeža.Isti madež smo odstranili in ponovno pregledali s protitelesi proti pan-ACT in β-aktinu.Ravni Pan-AKT v nevronskih gubah E8.5 (A, B) in ravni fosforiliranega S473-AKT v delih lobanje E9.5 so bile znatno zmanjšane.(F) Ravni Pan-AKT so bile podobno znižane v lizatih celic SPECC1L-kd U2OS, pobranih pri visoki sotočju.Vrstice napak predstavljajo SEM iz treh neodvisnih kvantifikacij Western blota.(GJ) Odseki zarodkov WT pri E9.5, obarvani s KI67 oziroma razcepljeno kaspazo 3, ki kažejo celično proliferacijo (G, G') in majhno apoptotično aktivnost (H, H').Specc11 mutirani zarodki kažejo primerljivo celično proliferacijo (I), vendar je število celic, ki so podvržene apoptozi, znatno povečano (J).
Nato smo pregledali markerje proliferacije in apoptoze.Nismo opazili nobene razlike v proliferaciji zarodkov E9.5 (slika 6E, G v primerjavi z I) z indeksom proliferacije 82,5 % za mutante WT in 86,5 % za mutante Specc1l, merjeno z barvanjem s KI67 (p <0,56, Fisherjev natančen test).Podobno nismo opazili nobene razlike v apoptozi, izmerjeni z barvanjem za razcepljeno kaspazo 3 v nevralnih gubah pri E8.5 do zaustavitve zarodka (ni prikazano) (ni prikazano).Nasprotno pa je bila apoptoza znatno povečana pri vseh mutiranih zarodkih E9.5 (slika 6F, H in J).To splošno povečanje apoptoze je skladno z zmanjšano signalizacijo PI3K-AKT in zgodnjo embrionalno smrtnostjo 29, 30, 31.
Nato smo za potrditev vzročne vloge za signalizacijo PI3K-AKT pri spremembah AJ v naših kd celicah kemično spremenili pot v kontrolnih in kd celicah (slika 7A-F).Kot označevalec smo uporabili fenotip spremembe oblike celice, opažen v konfluentnih celicah SPECC1L-kd, ki smo ga kvantificirali z uporabo razmerja med najdaljšo dimenzijo (dolžino) in ustrezno navpično dimenzijo (širino).Za razmeroma okrogle ali kockaste celice se pričakuje razmerje 1 (slika 7G).Poleg oblike celice smo potrdili tudi učinek na AJ z barvanjem z β-kateninom (sl. 7A'-F').Inhibicija poti PI3K-AKT z uporabo wortmanina je zadostovala za spremembo oblike celic v kontrolnih celicah (slika 7A, C) in AJ (slika 7A').PI3K-AKT aktivator SC-79 ni vplival na obliko celice (SL. 7A, E) ali širjenje AJ (SL. 7A') v kontrolnih celicah.V celicah SPECC1L-kd je nadaljnja supresija poti PI3K-AKT povzročila povečano apoptozo (sl. 7B, D) in izrazito povečanje obarvanja β-katenina (sl. 7B'), skladno z našimi težkimi mutanti in vivo.Pomembno je, da je aktivacija poti PI3K-AKT bistveno izboljšala celično obliko (slika 7B, F) in fenotipe AJ (slika 7B”).Spremembe v obliki celice so bile kvantificirane kot razmerje okroglosti celice (CCR) in primerjane glede pomembnosti, kot je opisano zgoraj (slika 7G).Dejansko je bilo v kontrolnih celicah (slika 7G, CCR = 1,56) obdelava z wortmaninom zadostna za znatno spremembo oblike celice (slika 7G, CCR = 3,61, p < 2,4 × 10-9) v obsegu, podobnem opazovanemu v SPECC1L.-kd celice (slika 7G, CCR = 3,46).Zdravljenje celic SPECC1L-kd z wortmaninom (slika 7G, CCR = 3,60, zanemarljivo) ni bilo pomembnejše kot neobdelane celice kd (slika 7G, CCR = 3,46, zanemarljivo) ali kontrolne celice, obdelane z wortmaninom (slika 7G)., CCR = 3,46, zanemarljivo) dodatno vpliva na raztezanje celic (7G, CCR = 3,61, zanemarljivo).Najpomembneje je, da je aktivator SC-79 AKT obnovil podaljšan fenotip celic SPECC1L-kd (slika 7G, CCR = 1,74, p <6,2 × 10-12).Ti rezultati potrjujejo, da SPECC1L uravnava signalizacijo PI3K-AKT, in kažejo, da zmerno zmanjšanje SPECC1L vpliva na celično adhezijo, medtem ko močno zmanjšanje vodi do apoptoze (slika 8).
(A–F') Kontrolne (A, C, E) in celice SPECC1L-kd (B, D, F), obdelane z zaviralcem poti PI3K-AKT wortmaninom (C, D) ali aktivatorjem SC-79 (E, F) Zdravljenje Neobdelane kontrolne celice so kockaste (A) z normalnim celičnim obarvanjem β-cat (A'), medtem ko so kd celice podolgovate (B) s povečanim obarvanjem β-cat (B').Po supresiji poti PI3K-AKT so se kontrolne celice podaljšale (C) z ekspanzijo β-cat (C'), medtem ko so kd celice začele prestajati apoptozo (D), podobno kot pri naših zelo mutiranih zarodkih in kažejo izjemno povečan β-cat.obarvanje (D').Po aktivaciji poti PI3K-AKT so kontrolne celice ostale kockaste (E) in imele normalno β-cat (E') obarvanje, medtem ko so kd celice pokazale znatno izboljšano celično obliko (F) in β-cat (F') obarvanje, kar kaže na (G) Stopnja spremembe oblike celice v (AF) je bila kvantificirana z uporabo razmerja okroglosti celice (CCR) najdaljše dimenzije (dolžine) in ustrezne navpične dimenzije (širine) z uporabo programske opreme MetaMorph.Neobdelane (NT) celice SPECC1L-kd (CCR = 3,46) so bile znatno daljše od kontrolnih celic (CCR = 1,56, p <6,1 × 10–13).Wortova inhibicija poti PI3K-AKT v kontrolnih celicah je zadostovala, da je povzročila podoben raztezek v obliki celice (CCR=3,61, p<2,4×10-9).Podobno je aktivacija AKT s SC-79 v celicah SPECC1L-kd obnovila raztezanje celic na kontrolne ravni (CCR = 1,74, p <6,2 × 10–12).Zdravljenje celic SPECC1L-kd z wortmaninom je povzročilo povečano apoptozo, vendar brez nadaljnjega povečanja spremembe oblike celic (CCR=3,60) v primerjavi z neobdelanimi kd (CCR=3,46, ns) ali kontrolnimi celicami, zdravljenimi z wortmaninom (3,61), opaženimi pri .ns = ni pomembno.Prikazane so +/- meritve SEM za 50 celic.Statistične razlike smo izračunali s Studentovim t-testom.
(A) Shematski prikaz inhibicije in aktivacije poti PI3K-AKT, ki povzroči spremembe AJ oziroma reševanje.(B) Predlagani model za stabilizacijo proteina AKT s SPECC1L.
Premigracijski CNCC zahtevajo lizo AJ, da se loči od nevroepitelnih celic sprednje nevralne gube 1,15,32.Povečano obarvanje komponent AJ in izguba apikalno-bazalne asimetrične porazdelitve AJ v celicah s pomanjkanjem SPECC1L tako in vitro kot in vivo v kombinaciji s fizično bližino SPECC1L β-kateninu kaže, da SPECC1L deluje tako, da pravilno vzdržuje lokalno stabilnost AJ za organizacijske mišice.aktinski citoskelet.Povezava SPECC1L z aktinskim citoskeletom in β-kateninom ter povečanje števila kondenziranih aktinskih filamentov v odsotnosti SPECC1L je skladna z opaženim povečanjem gostote AJ.Druga možnost je, da povečano število aktinskih vlaken v celicah s pomanjkanjem SPECC1L povzroči spremembo medcelične napetosti.Ker celični stres vpliva na dinamiko AJ 33, lahko spremembe napetosti povzročijo bolj razpršen AJ 34 .Vse spremembe bodo torej vplivale na plasti CNCC.
Wnt1 se izraža v zgodnjih nevralnih gubah, ki povzročajo celice nevralnega grebena.Tako sledenje rodu Wnt1-cre označuje NCC35 pred in selitvijo.Vendar pa Wnt1 označuje tudi klone dorzalnega možganskega tkiva, ki izhajajo tudi iz zgodnjih živčnih gub 35, 36, zaradi česar je verjetno, da naše obarvanje mutantov E9.5 za markerje Wnt1 v odprtih živčnih gubah ni CNCC.Naše pozitivno obarvanje za markerje NCC AP2A in SOX10 je potrdilo, da so izpostavljene nevralne gube mutantnih zarodkov Specc11 res vsebovale CNCC.Poleg tega, ker sta AP2A in SOX10 označevalca zgodnje selitve NCC, je pozitivno barvanje pokazalo, da so te celice postmigracijske CNCC, ki jih ni mogoče stratificirati z E9.5.
Naši podatki kažejo, da je molekularna regulacija AJ s SPECC1L posredovana s signalizacijo PI3K-AKT.Signalizacija AKT je zmanjšana v celicah in tkivih s pomanjkanjem SPECC1L.Ugotovitve Fantauzza et al.podpirajo neposredno vlogo signalizacije PI3K-AKT v kraniofacialni morfogenezi.(2014) so ​​pokazali, da pomanjkanje aktivacije signalizacije PI3K-AKT na osnovi PDGFRα vodi do fenotipa razcepa neba.Pokazali smo tudi, da je inhibicija poti PI3K-AKT zadostna za spremembo AJ in oblike celic v celicah U2OS.V skladu z našimi ugotovitvami so Cain et al.37 je pokazalo, da znižanje podenote PI3K α110 v endotelijskih celicah povzroči podobno povečanje obarvanja pericelularnega β-katenina, kar imenujemo povečanje "indeksa povezljivosti".Vendar pa v endotelijskih celicah, katerih aktinski filamenti so že visoko organizirani, zatiranje poti PI3K-AKT povzroči ohlapno celično obliko.V nasprotju s tem so celice SPECC1L-kd U2OS pokazale podolgovato celično obliko.Ta razlika je lahko specifična za tip celice.Medtem ko supresija signalizacije PI3K-AKT trajno vpliva na aktinski citoskelet, je učinek na celično obliko določen s spremembami napetosti, ki jih povzročajo spremembe v gostoti in organizaciji osrednjih aktinskih vlaken.V celicah U2OS smo uporabili samo spremembe oblike celic kot marker spremembe in okrevanja AJ s pomanjkanjem SPECC1L.Na koncu domnevamo, da zaviranje poti AKT pri pomanjkanju SPECC1L poveča stabilnost AJ in zmanjša delaminacijo v CNCC.
Zanimivo je, da so bile ravni pan-AKT zmanjšane in vitro in in vivo poleg fosforiliranih ravni 473-AKT v odsotnosti SPECC1L, kar kaže na regulacijo signalizacije PI3K-AKT na ravni stabilnosti ali prometa proteina AKT.Gena SPECC1L in MID1, oba povezana s sindromom Opitz/GBBB, kodirata proteine, ki stabilizirajo mikrotubule 18,22.Mehanizem, s katerim SPECC1L in MID1 posredujeta pri stabilizaciji mikrotubulov, ni popolnoma razumljen.V primeru SPECC1L ta stabilizacija vključuje okrepljeno acetilacijo podskupine mikrotubulov 18 .Možno je, da SPECC1L uporablja podoben mehanizem za stabilizacijo drugih proteinov, kot je AKT.Pokazalo se je, da acetilacija ostankov lizina v proteinu AKT vodi do zmanjšanja lokalizacije membrane in fosforilacije38.Poleg tega je za njeno membransko lokalizacijo in aktivacijo potrebna ubikvitinacija verige K63 pri istem ostanku lizina na AKT 39, 40.Med številnimi dejavniki, ki medsebojno delujejo s proteini SPECC1L, identificiranimi v različnih visokozmogljivih dvohibridnih zaslonih kvasovk, so bili štirje – CCDC841, ECM2942, APC in UBE2I43 – vpleteni v promet ali stabilnost beljakovin prek ubikvitinacije ali sumoilacije.SPECC1L je lahko vključen v posttranslacijsko modifikacijo lizinskih ostankov AKT, kar vpliva na stabilnost AKT.Vendar pa je treba kritično vlogo SPECC1L pri lokalizaciji in stabilnosti proteina AKT še pojasniti.
Hude okvare izražanja SPECC1L in vivo so povzročile povečano obarvanje markerjev AJ in okvarjeno prekrivanje CNCC, pa tudi povečano apoptozo in zgodnjo embrionalno smrtnost.Prejšnja poročila so pokazala, da so mišji mutanti s povečano stopnjo apoptoze povezani z okvarami nevralne cevi 44, 45, 46, 47 in kraniofacialnimi okvarami 48.Predlagano je bilo, da lahko prekomerna celična smrt v nevralnih gubah ali faringealnih lokih povzroči nezadostno število celic, potrebnih za pravilno morfogenetsko gibanje 48,49,50.Nasprotno pa so naše celične linije s pomanjkanjem SPECC1L z zmerno zmanjšano ekspresijo SPECC1L pokazale le spremembe AJ brez dokazov povečane celične smrti.Vendar pa je kemična inhibicija poti PI3K-AKT v teh celicah Kd povzročila povečano apoptozo.Tako zmerno zmanjšanje izražanja ali delovanja SPECC1L zagotavlja preživetje celice.To je skladno z opažanjem, da redki mutirani zarodki Specc11, ki se izognejo aretaciji pri st.E9.5 – morda zaradi zmanjšane učinkovitosti zajemanja genov – so sposobni zapreti svoje nevralne cevi in ​​se pozneje v razvoju ustavijo, pogosto s kraniofacialnimi okvarami (slika S3).Skladen s tem je tudi redek pojav heterozigotnih zarodkov Specc1l s kraniofacialnimi nepravilnostmi – verjetno zaradi povečane učinkovitosti zajemanja genov – kot tudi ugotovitev pri cebricah, pri katerih eden od dveh ortologov SPECC1L (specc1lb) povzroči pozne embrionalne fenotipe, vključno z izgubo spodnje čeljusti in obojestranske razcepe51.Tako lahko heterozigotne mutacije izgube funkcije SPECC1L, ugotovljene pri človeških bolnikih, povzročijo majhne okvare v funkciji SPECC1L med kraniofacialno morfogenezo, kar zadostuje za razlago njihovih orofacialnih razpok.Regulacija medceličnih stikov na osnovi SPECC1L ima lahko tudi vlogo pri palatogenezi in fuziji faringealnih lokov.Nadaljnje študije delovanja SPECC1L bodo pomagale razjasniti vlogo začasnih medceličnih stikov v CNCC med zaprtjem nevralne cevi pri gibljivosti nevroepitelnih celic in kraniofacialni morfogenezi.
Kontrola osteosarkoma U2OS in celice SPECC1L-kd so bile opisane prej (Saadi et al., 2011).Protitelesa proti SPECC1L so bila tudi prej opredeljena (Saadi et al., 2011).Protitelesa proti β-kateninu (kunec; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (miš; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), miozin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ), , MO) ), E-kadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , Kalifornija), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), fosfo-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), cepljena kaspaza 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) in β-aktin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) je bil uporabljen, kot je opisano..Aktinske filamente smo obarvali z Acti-stain rodaminom faloidinom (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Kontrolne celice U2OS in celice SPECC1L-kd smo gojili v standardnem DMEM z visoko vsebnostjo glukoze, dopolnjenem z 10 % fetalnega govejega seruma (Life Technologies, Carlsbad, CA).Za spremembe AJ smo 2 x 105 celic zasejali na steklo, obdelano z 0,1 % prašičje želatine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) in opazovali spremembe v obliki celic.Celice so bile zbrane v različnih navedenih časovnih točkah: 4 ure po setvi (t = 1), 24 ur po setvi (t = 2), sotočje brez spremembe oblike celice (t = 3), sprememba oblike celice (t = 4) , 24 ur po spremembi oblike celice (t = 5) in 48 ur po spremembi oblike celice (t = 6) (sl. 1, 2, 3).Za modulacijo poti PI3K-AKT smo celice gojili pri navedenih koncentracijah z zaviralcem PI3K-AKT vortmaninom (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) ali aktivatorjem SC-79 (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Medij, ki je vseboval kemikalije, je bil dnevno menjan.
Posnetki okvir za okvirjem so bili narejeni na kontrolnih v živo in celicah KD v normalnih pogojih kulture, fazno kontrastne slike pa so bile zbrane vsakih 10 minut 7 dni.Slike so bile pridobljene z računalniško vodenim invertnim mikroskopom Leica DM IRB, opremljenim z mehansko stopnjo in objektivom 10 × N-PLAN, povezanim s kamero QImaging Retiga-SRV.Med slikanjem smo celične kulture vzdrževali pri 37 °C v vlažnem ozračju s 5 % CO2.
Dve celični liniji ES z gensko pastjo DTM096 in RRH048 iz Regionalnega centra za mutirane miši (UC Davis, CA) sta bili uporabljeni za ustvarjanje linij miši s pomanjkanjem Specc11, označenih kot Specc1lgtDTM096 in Specc1lgtRRH046.Na kratko, celice 129/REJ ES so bile injicirane v blastociste C57BL6.Nastale himerne mišje samce so vzrejali s samicami miši C57BL6, da bi identificirali potomce z barvo dlake agouti.Za identifikacijo heterozigotov je bila uporabljena prisotnost vstavkov vektorjev genske pasti.Miši so hranili na mešanem ozadju 129/REJ; C57BL6.Lokacija vstavitvenega mesta vektorja genetske pasti je bila potrjena z RT-PCR, sekvenciranjem genoma in genetsko komplementacijo (dodatna slika 1).Da bi izsledili linijo CNCC dvojnih heterozigotnih Specc1lGT miši, so bile ROSAmTmG (#007576) in Wnt1-Cre (#003829) miši (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) križane, da bi proizvedli ROSAmTmG in Wnt1-Cre alel v Specc1l mutantnih zarodkih.Vsi poskusi na miših so bili izvedeni v skladu s protokoli, ki jih je odobril Odbor za institucionalno oskrbo in uporabo živali Medicinskega centra Univerze v Kansasu.
Zarodke smo 60 minut fiksirali v (1 % formaldehid, 0,2 % glutaraldehid, 2 mM MgCl2, 0,02 % NP-40, 5 mM EGTA) pri sobni temperaturi.Po fiksaciji v raztopini za barvanje X-gal (5 mM kalijevega fericianida, 5 mM kalijevega ferocianida, 2 mM MgCl2, 0,01 % natrijevega deoksiholata, 0,02 % NP-40, 1 mg/ml X-gal) je bil razvoj madežev izveden pri 37 °C. .°C v 1-6 urah.Zarodki so bili naknadno fiksirani v 4% PFA in vizualizirani.
Za Western blot smo celice lizirali v pufru za pasivno lizo (Promega, Fitchburg, WI), dopolnjenem z mešanico zaviralcev proteaze HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lizati so bili obdelani na 12% poliakrilamid Mini-PROTEAN TGX pripravljenih gelih (Bio-Rad, Hercules, CA) in preneseni na Immobilon PVDF membrane (EMD Millipore, Billerica, MA).Membrane so bile blokirane v 5% mleku v PBS, ki je vseboval 0,1% Tween.Protitelesa smo inkubirali čez noč pri 4 °C ali eno uro pri sobni temperaturi.Za generiranje signala je bil uporabljen reagent Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA).Za imunsko barvanje so bili zarodki čez noč fiksirani v 4% PFA/PBS in kriokonzervirani.Kriosekcije tkiv smo blokirali v PBS, ki je vseboval 1 % normalnega kozjega seruma (Thermo Scientific, Waltham, MA) in 0,1 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), nato pa jih inkubirali pri 4 °C v inkubatorju med noč.z anti-protitelesom in fluorescenčnim sekundarnim protitelesom (1:1000) 1 uro pri 4 °C.Obarvane odseke smo dali v zlati medij ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) in ravne slike smo dobili z uporabo konfokalnega mikroskopa Leica TCS SPE.Vsako imunsko barvanje je bilo izvedeno kot trije neodvisni poskusi na cirosekcijah vsaj dveh mutiranih zarodkov.Prikazan je reprezentativen poskus.
Celice smo inkubirali v modificiranem pufru RIPA (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 % NP-40, 130 mM NaCl, 10 % glicerola, 2 mM EDTA in zaviralec proteaze HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Na kratko, lizate smo predhodno prečistili z magnetnimi kroglicami proteina G (Life Technologies, Carlsbad, CA) in nato inkubirali čez noč pri 4 °C z anti-SPECC1L ali IgG proteinske kroglice G proteina smo uporabili za ekstrakcijo SPECC1L in izvedli Western blotting z uporabo anti-SPECC1L. -β-kateninsko protitelo, opisano zgoraj. Prikazani poskusi co-IP so reprezentativni za štiri neodvisne poskuse.
Fiksne kultivirane celice ali tkiva mišjih zarodkov so prejeli v center za elektronsko mikroskopijo v Medicinskem centru Univerze v Kansasu.Na kratko, vzorci so bili vstavljeni v smolo EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polimerizirani čez noč pri 60 °C in razrezani pri 80 nm z uporabo ultramikrotoma Leica UC7, opremljenega z diamantnim rezilom.Sekcije so bile vizualizirane s transmisijskim elektronskim mikroskopom JEOL JEM-1400, opremljenim s 100 kV pištolo Lab6.
Kako citirati ta članek: Wilson, NR et al.Pomanjkanje SPECC1L povzroči povečano stabilnost spojenih sklepov in zmanjšano razslojevanje celic lobanjskega nevralnega grebena.znanost.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Indukcija in diferenciacija živčnega grebena.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Celice kranialnega živčnega grebena v gibanju: njihova vloga pri kraniofacialnem razvoju.American Journal of Medical Genetics.Del A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Nevrokristopatija: njena rast in razvoj v 20 letih.Pediater.patologija.laboratorij.zdravilo.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU in Noten MM Preboj v genetiki orofacialnih razcepov.Trendi v molekularni medicini 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. in Riley, FM Molekularni mehanizmi migracije in oblikovanja celic kranialnega živčnega grebena med kraniofacialnim razvojem.Razvoj 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH in Murray, JK Razcepljena ustnica in nebo: razumevanje genetskih in okoljskih vplivov.naraven komentar.Genetika 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Nenormalna morfogeneza kože, udov in kraniofacialne regije pri miših s pomanjkanjem faktorja 6 (Irf6), ki uravnava interferon.National Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Dominantne mutacije v GRHL3 povzročajo van der Waordov sindrom in poslabšajo razvoj ustnega periderma.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ in Juriloff, DM Posodobite seznam mišjih mutantov z napakami v zaprtju nevralne cevi in ​​napredujte k popolnemu genetskemu razumevanju zaprtja nevralne cevi.Preiskava prirojenih okvar.Del A, Klinična in molekularna teratologija 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-posredovana signalizacija PDGFRalpha uravnava preživetje in proliferacijo v razvoju skeleta prek p53-odvisne znotrajcelične poti.Genski razvoj 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND in Murdoch, JN Disheveled: Odnos konvergentne ekspanzije do zaprtja nevralne cevi.Trendi v nevrologiji.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).